张 婷 刘安韬▲ 刘喜华 卢月妹

1.广西卫生职业技术学院药学系，广西南宁 530023；2.右江民族医学院，广西百色 533000

皂布叶为鼠李科植物尼泊尔鼠李[Rhamnus napelensis（Wall.）Laws.]的全株，主治风湿关节痛、慢性肝炎、肝硬化腹水等病症[1]，刘安韬等[2]对皂布叶的研究表明，皂布叶有良好的抗痛风作用。皂布叶中主要成分为蒽醌类化合物[3]，但目前未见皂布叶蒽醌类化合物的测定方法，本文采用醋酸镁-甲醇显色法，建立了超声提取-分光光度法测定皂布叶中总蒽醌含量的方法，为该药材的质量研究和产品开发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

普析通用TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），KQ2200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DFT-100高速粉碎机（大德药械有限公司），赛多利斯分析天平BSA8201[赛多利斯（上海）贸易有限公司]，XS204电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]，HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）。

1，8-二羟基蒽醌（对照品，中国食品药品检定研究院，批号：110829-9702）；醋酸镁、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均为分析纯），均购自成都市科隆化学品有限公司。

共收集了12批次皂布叶样品，采收于广西武鸣县，靖西县等地，分别编号为1～12号，干燥粉碎后备用。见表1。

表1 皂布叶样品信息表

1.2 试剂及溶液配制

蒽醌标准溶液（0.1037 mg/ml）：精密称取10.37 mg 1，8-二羟基蒽醌，至100 ml量瓶，加甲醇适量溶解，用甲醇稀释至刻度。

醋酸镁-甲醇溶液（质量分数为0.5%）：称取2.50 g醋酸镁溶于500 ml甲醇中，储于棕色瓶中保存备用。

1.3 样品溶液制备

精密称取0.200 g样品粉末于100 ml锥形瓶中，加入50 ml 50%甲醇，超声（常温）提取30 min，放冷，补足重量，过滤。精密量取取25 ml提取液于烧杯中水浴蒸干至约2 min，加入15 ml 3.0 mol/L盐酸，水浴水解30 min，取出冷却后，用乙酸乙酯萃取10 ml（5 ml×2），合并乙酸乙酯液蒸干，加甲醇溶解，转移至25 ml量瓶，加甲醇至刻度。精密量取1 ml至50 ml量瓶，加4 ml醋酸镁-甲醇显色，加甲醇至刻度。

1.4 标准曲线的绘制

分别准确吸取蒽醌标准溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml置于50 ml容量瓶中，分别加入醋酸镁-甲醇溶液4 ml，摇匀显色，加甲醇定容至刻度，以试剂空白为参比，在230 nm处测定吸光度（A）。以蒽醌质量浓度（C）为横坐标（µg/ml），吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线并拟合回归方程，结果见图1。从图1可知，醋酸镁－甲醇法测定总蒽醌的回归方程为：A=0.78C+0.0419，R2=0.9962，在0.002074～0.01037 mg/ml范围内线性关系良好。

图1 标准曲线与回归方程

2 结果

2.1 测定波长的确定

吸取蒽醌标准溶液1 ml于比色管中，按照“1.4”项下显色后，于紫外可见分光光度计上扫描吸收曲线。可知，最大吸收波长为230 nm，因此，选择230 nm为测定波长，见图2。

图2 吸收光谱

2.2 提取溶剂对提取蒽醌浓度的影响

采用同一批次皂布叶样品Z4，按“1.3”项下超声提取法的步骤，考察了不同溶剂类型及溶剂浓度对检测结果的影响。分别选择甲醇和乙醇作为提取溶液剂，甲醇对皂布叶总蒽醌的提取效果明显好于乙醇；通过不同浓度甲醇提取浓度对比显示，50%甲醇提取的浓度更高，因此，选择超声提取的最佳溶剂和浓度为50%甲醇，见表2。

表2 不同溶剂类型及溶剂浓度对提取蒽醌质量浓度的影响

2.3 提取时间及温度对提取蒽醌浓度的影响

采用同一批次皂布叶样品Z4，按“1.3”项下超声提取法的步骤，考察了超声提取温度及时间对检测结果的影响。随着提取时间的增加，皂布叶中蒽醌浓度有明显的提高，但提取时间超过50 min后，蒽醌类氧化变色浓度开始明显下降；提取温度对于皂布叶中总蒽醌提取浓度影响不明显。因此，选择超声提取的最佳时间为30 min，选择超声提取的最佳温度为40℃，见图3及表3。

表3 提取温度对提取蒽醌浓度的影响

图3 超声提取时间对提取蒽醌浓度的影响

2.4 显色剂（醋酸镁溶液）用量对蒽醌浓度测定的影响

采用同一批次皂布叶样品Z7，取0.200 g按“1.3”项下超声提取法的步骤，考察了不同显色剂用量对检测结果的影响。不同显色剂用量对于皂布叶中蒽醌浓度测定有一定影响，在药材取样0.200 g时，用醋酸镁4 ml，测定结果稳定，效果良好。见表4。

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性 取标准曲线中6.22 µg/ml的对照品溶液，照“1.4”项下操作，在230nm波长下，分别在0、2、4、8、10、12、24、48 h测定其吸光度。吸光度RSD值为0.182%，见表5。

表5 稳定考察表

2.5.2 重复性 取2.5.1项0 h溶液，同法测定6次。结果吸光度RSD值为0.0747%。见表6。

表6 重复性考察表

2.5.3 加样回收率 精密称取皂布叶样品Z8，0.202 g，照“1.3”项下操作至精密量取1 ml，至50 ml量瓶，平行制备3份，分别加入0.002074、0.003111、0.004148 mg 1，8-二羟基蒽醌，加4 ml醋酸镁-甲醇显色，加甲醇至刻度，同法每份再平行配置两份。照“1.4”项下测定总蒽醌含量，计算加样回收率。平均回收率为95.71%，RSD值为1.24%，见表7。

表7 加样回收率考察表

2.6 样品含量测定

对12个批次皂布叶样品（1～12号）进行干燥粉碎后，按“1.3”项下操作，照紫外-可见分光光度法，在230 nm波长下测定，计算含量。皂布叶中总蒽醌的含量最高可达52.44 mg/g，最低为23.08 mg/g，平均含量为37.64 mg/g；对照药材采收表，皂布叶药材在9～10月份含量达到较高值，随着植物开花结果，全株药材的蒽醌物质含量有下降趋势，一般在1～2月降到最低，见表8。

表8 12个批次皂布叶样品总蒽醌含量

3 讨论

本研究建立了以超声提取-盐酸水解-乙酸乙酯萃取为预处理手段，以醋酸镁-甲醇显色测定皂布叶中总蒽醌质量浓度的方法，本方法操作安全、简单，操作效率高，且精密度好，结果稳定可靠。其中超声提取法广泛用于中药材中总蒽醌的提取[4-6]，通过对影响提取率的温度、时间[7]、超声功率[8]和溶剂种类[9-10]、浓度等因素的考察，采用单因素法、正交实验法或响应面分析法[11-12]优化实验方案，因此本研究在进行提取方法考查中仅对超声提取的温度、时间和提取溶剂等主要条件进行考查，并得到了良好的效果。

醋酸镁-甲醇法主要针对游离态蒽醌进行显色测定，提取液中总蒽醌与醋酸镁的充分结合会明显影响测定结果，因此本研究考查了醋酸镁溶液的用量，保证显色的稳定性，另外溶液中酸的存在也会影响降低吸光度值[13]，因为酸会对蒽醌与镁离子生成的络合物稳定性产生影响，所以收集到的乙酸乙酯萃取液一定要用水洗到中性。

皂布叶中化学成分以多酚类为主，其中的蒽醌类成分显示出良好的抗炎，抑菌和抗氧化等[14-17]药理活性，本研究以前期皂布叶提取物抗痛风作用[2]为基础，针对药材中主要的有效成分蒽醌类化合物建立测定方法研究，皂布叶药材在9～10月份含量达到较高值，随着植物开花结果，全株药材的蒽醌物质含量有下降趋势，为进一步规范药材使用，规范药材质量有一定的现实意义。

采用紫外-可见分光光度法进行含量测定具有较好的专属性和广泛的应用范围，在确定吸收波长条件下可以实现快速侦测。但由于光谱法本身的条件限制，测定样品的浓度过高会影响测定的准确度，另外会有同吸收峰的物质所干扰，影响准确度。高效液相色谱（HPLC）主要利用物质理化性质上的差异进行分离和定量测定。HPLC专属性强，准确度更高，但在含量测定中，对样品的组分的结构、性质的明确性要求较高，测定成分更明确，所需时间长。本研究主要针对皂布叶药材中蒽醌类成分进行测定，而不是单体成分，测定方法便捷，结果稳定可靠，可以作为皂布叶药材质量控制的方法。在以后的研究中，课题组将进一步深入研究该药材的药效成分，建立专属性更强的测定方法。