伍思蓉，蔡 霈，袁 庆，曹建国，杨小平，2，张坚松*

(1.湖南师范大学医学院，中国 长沙 410006；2.湖南省小分子靶向药物研究与创制重点实验室，中国 长沙 410006；3.湖南省妇幼保健院药剂科，中国 长沙 410013)

肺癌是全世界最常见的癌症死亡原因之一，每年估计有160万人死亡[1]。肺癌可以分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(NSCLC)，其中，约85%的肺癌患者具有NSCLC组织学亚型[2]。早在2008年，Eramo团队发现非小细胞肺癌中存在罕见未分化细胞群，该细胞群高表达CD133，并具有高致瘤性[3]。笔者的前期研究支持上述结果，通过干细胞条件培养悬浮培养可富集具有干细胞特性的球形成细胞，即肿瘤干细胞样细胞，具有CSCs特性[4]。MicroRNA(miRNA)是长度为18至25个核苷酸的内源性非编码RNA，涉及广泛的基本细胞生物学过程，例如细胞分化、增殖、生长、迁移、凋亡以及肿瘤发生[5]。多项研究证明NSCLC中存在大量肿瘤相关miRNAs。通过对GEO数据库中多个数据集(GSE29248，GSE56036和GSE102287)进行高通量数据的分析发现，miR-127-5p在NSCLC组织中高表达，可能具有肿瘤促进作用。有研究表明，miR-127-5p在多种疾病中具有重要作用，包括肝细胞癌[6]、宫颈癌[7]以及乳腺癌[8]等。因其在NSCLC中的作用及功能还未见研究报道，本研究拟探索miR-127-5p非小细胞肺癌细胞干细胞特性的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞系 H358和A549购自中国科学院细胞库(中国上海)，用含10%胎牛血清(FBS)，1×105IU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI-1640培养基置于37 ℃下含5%CO2的增湿培养箱中培养。

1.2 细胞转染

RNA oligo(包括miR-127-5p mimic, mimic control, miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control)购于吉玛基因(中国苏州)。取生长状态良好的H358和A549细胞，待细胞融合度达到70%后根据操作规范进行转染。取3.75 μL脂质体Lipofectamine 3000用125 μL opti-MEM稀释，另取18.8 μL RNA oligo(20 μmol·L-1)也用125 μL opti-MEM稀释。稀释的 Lipofectamine 3000 和稀释的 RNA oligo 混合，室温静置 5 min，将混合液加入培养液，放入二氧化碳培养箱中继续培养，24 h后通过实时荧光定量 PCR检测 miR-127-5p 的表达变化，48 h后检测蛋白变化。

1.3 实时荧光定量 PCR

用TRIzol (美国Life Technologies公司) 提取总RNA。取 500 ng 总 RNA采用加尾法进行反转录。实时定量 PCR 试剂为Power SYBR©Green PCR Master Mix，CT值(阈值循环数)用于定量各组模板的相对量。通过各自的管家基因 U6校正[ΔCT=CT(GENE)-CT(U6)]，再与对照组相比，通过 2-ΔΔCT计算[ΔΔCT=ΔCT(GENE)-ΔCT(control)]。miR-127-5p 前向引物序列为 5’-CGCTCTGTCATTCTGTAGGCCAAT-3’，U6 前向引物序列为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，通用的反向引物序列为5’-GATCGCCCTTCTACGTCGTAT-3’。

1.4 H358和A549球形成细胞培养及球形成率测定

H358和A549细胞以2 000个细胞/孔的密度悬浮在肿瘤干细胞条件培养基中(由无血清DMEM/F12(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1×105IU·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素，20 μg·L-1hbFGF(Invitrogen)，20 μg·L-1hrEGF(Invitrogen)，2%B27(Invitrogen)，4 mg·L-1胰岛素(Sigma-Aldrich)和0.4%BSA(Invitrogen)组成)，用超低黏附六孔板培养，每2 d换液一次，每5 d传代。

用miR-127-5p mimic,mimic control，miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control分别转染H358和A549细胞48 h。随后，肿瘤干细胞条件培养基进行球培养， 转染后的H358和A549细胞以2 000个细胞/孔的密度接种于24孔超低黏附培养板 (美国Corning Inc公司) 培养6 d。在显微镜下观察球形成情况。球形成率(%)=每孔形成的肿瘤球均数/每孔接种的活细胞数×100%。

1.5 transwell小室侵袭实验

miR-127-5p mimic，mimic control，miR-127-5p inhibitor以及inhibitor control分别转染H358和A549细胞48 h后，胰蛋白酶消化，计数，用无血清培养基重悬，调整细胞浓度为1×109·L-1，取200 μL上述细胞悬液接种于transwell小室(美国Corning Inc公司)的上室，下室加入600 μL含10%FBS的完全培养基。置于37 ℃下含5%CO2的增湿培养箱中孵育24 h后吉姆萨染色，显微镜下观察计数侵袭细胞数。 细胞侵袭率(%)=侵袭细胞数/每孔接种的活细胞数×100%。

1.6 蛋白质印记

按照文献[4]所述进行蛋白质印记实验。兔抗人PTEN单克隆抗体作为一抗，购于Cell Signaling Technology(9559S，美国)；兔抗人PCNA单克隆抗体购于Cell Signaling Technology(13110S，美国)。通过Image J软件测量每个条带的灰度值。β-actin作为加样对照。

1.7 荧光素酶报告基因实验

采用TargetScan等预测miR-127-5p的潜在靶标。根据预测结果，设计PTEN的突变序列和野生序列，并进行克隆。用miR-127-5p mimic或miR-127-5p阴性对照物分别与上述报告基因共转染293T细胞，测定荧光素酶的相对活性。海肾荧光素酶活性用作标准化对照。

1.8 统计学分析

使用SPSS 20.0软件(SPSS Inc，Chicago，IL)进行数据分析，数据以3次独立实验的平均值±标准差(SD)表示，单因素方差分析(One Way ANOVA)检验组间均数的统计学意义，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 H358和A549球形成细胞中miR-127-5p的表达

笔者前期通过对GEO数据库中多个关于NSCLC非编码RNA芯片数据(GSE29248，GSE56036和GSE102287)分析发现，3个芯片数据中miR-127-5p在NSCLC组织中存在差异表达(图1A)。采用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)对miR-127-5p的表达进行分析发现，其在NSCLC组织中高表达且有统计学意义(图1B)。比较非小细胞肺癌H358和A549细胞球形成细胞和亲本细胞中miR-127-5p的表达，可发现miR-127-5p在球形成细胞中显著高表达(图1C和D)。

图1 (A) miR-127-5p在GSE29248，GSE56036和GSE102287芯片数据中差异表达；(B)生物信息学分析非小细胞肺癌组织和癌旁组织中miR-127-5p的表达; (C) A549细胞及其球形成细胞中miR-127-5p的表达; (D) H358细胞及其球形成细胞中miR-127-5p的表达

2.2 miR-127-5p对非小细胞肺癌H358和A549细胞球形成的影响

图2 RNA oligo转染后H358和A549细胞中miR-127-5p的表达

为了验证miR-127-5p对非小细胞肺癌H358和A549细胞球形成的影响，笔者分别采用miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor转染H358和A549细胞。如图2所示，miR-127-5p mimic转染后，H358和A549细胞中miR-127-5p的表达均显著增加；相反，miR-127-5p inhibitor显著下调两者的miR-127-5p水平，说明转染效率较高。

随后，采用球形成实验检测miR-127-5p的表达水平对H358和A549细胞球形成的影响。如图3所示，与mimic control组相比，miR-127-5p mimic显著促进H358和A549细胞球形成；与inhibitor control组相比，miR-127-5p inhibitor转染后，球形成率明显降低。这提示miR-127-5p对H358和A549细胞球形成能力具有促进作用。

2.3 miR-127-5p对非小细胞肺癌A549细胞中PCNA蛋白表达的影响

为进一步验证miR-127-5p对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，笔者分别采用miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor转染A549细胞和H358细胞，随后检测其对增殖标记蛋白PCNA表达的影响。结果发现过表达miR-127-5p显著增加PCNA的表达，miR-127-5p inhibitor转染组A549细胞和H358细胞中PCNA蛋白表达水平均明显降低(图4)，提示miR-127-5p促进非小细胞肺癌细胞增殖。

图4 miR-127-5p诱导非小细胞肺癌细胞A549(A)和H358(B)中PCNA蛋白的表达

2.4 miR-127-5p对非小细胞肺癌H358和A549细胞侵袭能力的影响

细胞侵袭是反映肿瘤细胞干细胞样特性的一个重要功能，研究表明肿瘤干细胞样细胞较亲本细胞具有更高的侵袭能力[9]。为了进一步验证miR-127-5p对非小细胞肺癌细胞干细胞样特性的影响，笔者采用transwell小室侵袭实验分别检测miR-127-5p mimic及miR-127-5p inhibitor转染对H358和A549细胞侵袭能力的影响。如图5所示，miR-127-5p mimic可显著诱导H358和A549细胞侵袭，反之miR-127-5p inhibitor转染组H358和A549细胞侵袭率明显降低，提示miR-127-5p可促进非小细胞肺癌细胞侵袭。

图5 miR-127-5p促进H358和A549细胞的侵袭

2.5 miR-127-5p靶向抑制PTEN的表达

笔者采用TargetScan等预测发现miR-127-5p与PTEN存在结合位点(图6A)，荧光素酶报告基因实验验证了这一推测。miR-127-5p mimic转染组中WT PTEN报告基因的活性明显低于mimic control转染组(图6B，P=0.004 6)，提示miR-127-5p与PTEN存在直接相互作用。检测miR-127-5p mimic和miR-127-5p inhibitor转染后A549细胞中PTEN的表达，如图6C和D，笔者发现miR-127-5p mimic转染显著抑制PTEN的表达，而miR-127-5p inhibitor转染组A549细胞中PTEN的表达明显增加。以上结果提示，miR-127-5p靶向下调PTEN的表达。

图6 (A)生物信息学预测miR-127-5p和PTEN的结合位点；(B)荧光素酶报告基因实验验证miR-127-5p和PTEN的相互作用；(C，D)miR-127-5p抑制非小细胞肺癌A549细胞中PTEN的表达

3 讨论

MicroRNA(miRNA)是长度为18至25个核苷酸的内源性非编码RNA，他们通过与靶基因的3′UTR(非翻译区)结合，在转录后水平上调节mRNA的稳定性[10]，因此涉及广泛的基本细胞生物学过程，例如细胞分化、增殖、生长、迁移和凋亡以及肿瘤发生。亦有研究表明，在非小细胞肺癌中，miRNA参与调节上皮-间质转化、转移、侵袭等过程[11,12]。因此，笔者认为：明确各种致癌基因和肿瘤抑制基因的miRNA对认识NSCLC的发生发展可能具有深远的意义，其可能用于早期检测和分子分类、预后分期、治疗效果的预测和个体化治疗。有研究表明，miR-127-5p在多种疾病中具有重要作用，包括肝细胞癌[6]、宫颈癌[7]、乳腺癌[8]等。本研究中，笔者证明了miR-127-5p在NSCLC组织中高表达，通过比较非小细胞肺癌H358和A549细胞球形成细胞和亲本细胞中miR-127-5p的表达，发现miR-127-5p在球形成细胞中显著高表达，提示miR-127-5p可能具有肿瘤促进作用。进一步研究发现，miR-127-5p对H358和A549细胞球形成能力和侵袭能力具有正调控作用。有研究证明通过干细胞条件培养基悬浮培养可以富集肿瘤干细胞样细胞，并且通过球形成能力的测定可以检测肿瘤干样细胞的自我更新能力[4]。以上结果表明miR-127-5p对非小细胞肺癌H358和A549细胞自我更新能力具有促进作用。

磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology, PTEN)可参与细胞周期的调节，抑制肿瘤细胞的增殖、黏附、转移、血管生成，促进细胞的凋亡、分化、衰老等多种生理和病理活动。研究表明，PTEN是最常失活的抑癌基因之一，在许多肿瘤中表达显著降低[13]。Kuang与其同事发现miR-127-5p可靶向抑制PTEN/AKT信号通路[14]。有研究表明，PTEN/PI3K/AKT信号通路参与调节顺铂耐药的非小细胞肺癌进展[15]。以上研究提示PTEN可能参与NSCLC的进展。本研究利用荧光素酶报告基因实验得出了相似的结论，即miR-127-5p与PTEN存在相互作用；本研究还发现，在非小细胞肺癌A549细胞中，过表达miR-127-5p显著下调PTEN的表达，而抑制miR-127-5p的表达则导致PTEN的表达水平增加。这提示miR-127-5p对非小细胞肺癌H358和A549细胞自我更新和侵袭能力的促进作用可能与PTEN蛋白下调有关。

综上所述，本研究发现：1) miR-127-5p在非小细胞肺癌组织及球形成细胞中高表达；2) miR-127-5p促进非小细胞肺癌H358和A549细胞自我更新和侵袭能力；3) miR-127-5p可以靶向抑制PTEN从而发挥其肿瘤促进作用。本研究将为临床上非小细胞肺癌的早期检测和治疗提供参考。