王晓磊 高彦彬 张涛静

足细胞损伤是糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)肾纤维化发生发展的重要因素之一。转分化作为足细胞损伤的一种重要形式，在与足细胞损伤相关的疾病进程中发挥着重要作用。在慢性高血糖等持续刺激下，足细胞将失去自身成熟细胞的细胞表型标志物(如nephrin)，而间充质细胞样表型标志物，如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表达增多[1-2]。获得间充质细胞表型后的足细胞迁移能力增强，并能够产生不必要的胶原等纤维蛋白，进而促进肾纤维化的进展[3]。既往研究发现miRNA-155是肾纤维化的主要致病因子之一，在肾纤维化的进程中发挥着关键作用[4]。笔者研究团队前期研究发现，中药芪卫颗粒能改善DKD足细胞损伤，起到延缓肾纤维化进展的作用，但其相关机制尚不清楚[5]。因此，本研究将在以往研究的基础上，以miRNA-155为切入点，采用体外实验观察芪卫颗粒对高糖诱导的足细胞转分化及miRNA-155的影响，部分阐明芪卫颗粒改善足细胞损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

小鼠肾足细胞株(MCP5)购自北纳生物(货号：BNCC337685)。

1.2 实验药物与主要试剂

芪卫颗粒(药物组成：黄芪、鬼箭羽、生地黄、大黄、莪术，质量比例为3∶3∶3∶2∶2)由北京中医药大学东方医院制剂室制备。

DMEM低糖培养基和胎牛血清购自美国Gibio公司，兔源多克隆nephrin抗体购自美国Novus Biologicals公司(货号：NBP1-77303)，兔源多克隆α-SMA抗体购自美国Abcam公司(货号：ab5694)，miRNA-155 inhibitor试剂盒套装购自广州锐博生物(货号：miR20000165-1-5)，CCK-8法细胞增殖检测试剂盒购自南京凯基生物(货号：KGA317)。

1.3 含药血清的制备

选取雄性SPF级SD大鼠20只(体重为180±20 g)，随机分为芪卫颗粒组和空白对照组(分别用于制备含药血清及空白血清)2个组，每组10只。其中芪卫颗粒组大鼠予芪卫颗粒生药量20 g/(kg·d)灌胃(依照前期动物实验剂量[6])，空白对照组给予等体积蒸馏水灌胃，每天一次，连续灌胃7天，于第7天灌胃结束后2小时经大鼠腹主动脉取血，每只大鼠取血量8～10 mL，室温静置并离心取血清，经56℃水浴灭活后于-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.4 足细胞培养及分组

在含5%的CO2培养箱中用DMEM低糖培养基(含10%胎牛血清及10 U/mL γ-干扰素)培养足细胞，33 ℃环境下诱导细胞增殖，37 ℃环境下诱导细胞分化(不含γ-干扰素)。将处于对数期分化成熟的足细胞用于实验。细胞共分为4个组：正常组，高糖组，芪卫颗粒组和miRNA-155基因敲减组。其中正常组予2.5%空白血清+DMEM低糖培养基培养，高糖组予2.5%空白血清+DMEM高糖培养基(葡萄糖浓度为30 mmol/L，下同)培养，芪卫颗粒组予2.5%含药血清+DMEM高糖培养基培养，miRNA-155基因敲减组先予miRNA-155 inhibitor转染足细胞敲减miRNA-155(具体操作依照miRNA-155 inhibitor试剂盒说明书)，再予2.5%空白血清+DMEM高糖培养基培养。各组细胞干预48小时，随后收集细胞进行相关检测。

1.5 观察指标及采用的检测方法

CCK-8方法检测各组细胞活力。将足细胞接种至96孔板中，每孔体积100微升，同时设置5个复孔，按上述分组培养24小时后加入10微升 CCK-8反应液，于37 ℃烘箱反应1小时后，采用酶标仪检测波长为450 纳米的OD值并计算细胞活力(实验组OD值/正常组OD值×100 %)，同样方法依次检测培养48小时及72小时的细胞活力值。

实时荧光定量PCR(real time PCR， RT-PCR)方法检测足细胞nephrin基因、α-SMA基因和miRNA-155基因的表达水平。提取各组实验细胞总RNA，经逆转录并上机后，根据得到的荧光信号计算Ct值及基因的相对表达量。Nephrin基因和α-SMA基因以GAPDH基因作为对照基因，miRNA-155基因以U6基因作为对照基因，每个实验独立重复3次。检测指标引物序列见表1。

表1 足细胞检测相关指标引物序列

蛋白质印迹法检测足细胞nephrin蛋白及α-SMA的蛋白表达水平。提取总蛋白，经BCA试剂盒进行浓度测定后，对蛋白进行电泳，转膜，封闭等处理，随后4℃环境中孵育一抗过夜，第二天37℃环境中封闭1小时，并孵育二抗，最后经显影获得目的条带，并分析蛋白相对表达量，每组实验独立进行3次。一抗稀释比例为：nephrin(1∶1000)，α-SMA(1∶1000)。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 芪卫颗粒含药血清对细胞活力的影响

不同组别足细胞干预24小时、48小时、72小时的OD值结果如表2所示：随着时间延长，各组细胞的OD值呈下降趋势。在同一孵育时间里，高糖组足细胞OD值较正常组明显下降(P<0.05)，而与高糖组相比，芪卫颗粒组和miRNA-155基因敲减组足细胞OD值有所增加(P<0.05)。提示高糖环境下培养的足细胞的细胞活力显著下降，经芪卫颗粒干预或敲减miRNA-155处理后细胞活力能明显升高。72小时正常组足细胞OD值较24小时组及48小时组有明显下降，后续实验均采用48小时组。

表2 不同时间点各组足细胞OD值的比较

2.2 芪卫颗粒含药血清对足细胞转分化基因表达相关指标的影响

各组细胞转分化相关指标nephrin基因和α-SMA基因的表达水平，结果如表3所示：与正常组足细胞相比，高糖组细胞nephrin的基因表达水平明显下降(P<0.05)，而α-SMA的基因表达水平明显升高(P<0.05)；与高糖组细胞相比，芪卫颗粒组和miRNA-155基因敲减组足细胞nephrin的基因表达水平明显有所上调(P<0.05)，而α-SMA的基因表达水平明显下调(P<0.05)。

表3 各组足细胞转分化相关指标的基因相对表达水平比较

2.3 芪卫颗粒含药血清对足细胞转分化蛋白表达相关指标的影响

各组细胞转分化蛋白表达相关指标nephrin蛋白和α-SMA蛋白的结果如表4所示：相较于正常组足细胞，高糖组细胞nephrin的蛋白表达水平明显下降(P<0.05)，α-SMA的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；而与高糖组相比，芪卫颗粒组和miRNA-155基因敲减组足细胞nephrin的蛋白表达水平明显上调(P<0.05)，α-SMA的蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。

表4 各组足细胞转分化相关指标的蛋白相对表达水平比较

2.4 芪卫颗粒含药血清对足细胞miRNA-155基因表达的影响

各组细胞干预48小时后，miRNA-155的基因表达水平结果如表5所示：与正常组细胞相比，高糖组细胞miRNA-155的基因表达水平明显升高(P<0.05)；而与高糖组相比，芪卫颗粒组细胞miRNA-155的基因表达水平明显下调(P<0.05)，miRNA-155基因敲减组足细胞中miRNA-155的基因表达水平处于较低表达水平。

表5 各组足细胞中miRNA-155基因的相对表达水平比较

3 讨论

足细胞损伤是导致DKD发生发展的重要因素，其损伤形式包括细胞转分化、细胞肥大、细胞凋亡等，其中转分化可于足细胞损伤早期出现，因此，早期抑制转分化，阻止足细胞发生脱落及凋亡，对于延缓DKD的病程进展起着重要作用[1]。

miRNA是一类长度为22～25个核苷酸的内源性非编码RNA分子，通过特异性结合靶基因的3′-UTR发挥转录调节作用[7]。研究发现miRNA在DKD足细胞损伤中发挥着重要作用。如抑制miRNA-21的表达水平可以可以减轻DKD大鼠炎症反应，其机制是通过提高靶向基因TIMP3的表达水平来减轻足细胞凋亡实现的[8]；抑制miRNA-217的表达能减轻高糖环境介导的足细胞损伤和胰岛素抵抗，其机制是通过上调miRNA-27靶基因PTEN的表达水平来增强自噬水平实现的[9]；miR-377通过与长链非编码RNA TUG1内源性竞争结合靶基因PPARγ来促进DKD小鼠外基质积聚，促进DKD病程进展，增加长链非编码RNA TUG1的表达或者抑制miRNA-377的表达可以抑制DKD病程进展[10]。新近的一些研究表明在DKD中，miRNAs参与了细胞转分化，如miRNA-21通过促进肾小管上皮细胞转分化加重DKD肾纤维化进展[11]，而miRNA-93通过抑制肾小管上皮细胞转分化延缓DKD肾纤维化进程[12]等。先前研究发现抑制miRNA-155可以改善TGF-β1诱导的足细胞凋亡[13]，但miRNA-155是否参与足细胞转分化仍未可知。

基于中医络病理论，笔者认为肾络的病变是贯穿于DKD始终的病理基础，本病的病机早期以气阴两虚、肾络瘀滞为主[14]。芪卫颗粒是根据该病机研制的中药新药，其功效是益气养阴，化瘀通络。前期临床研究表明芪卫颗粒能明显降低早期DKD患者的尿蛋白水平、延缓肾功能[15-16]。该药的前期基础研究表明其能够抑制DKD大鼠肾小球系膜基质增生[17]，上调nephrin蛋白表达，改善足细胞足突融合[5]。但其相关机制仍需阐明。

笔者团队在前期工作基础上，提出并验证了如下设想：芪卫颗粒可以通过调控足细胞miRNA-155的表达水平来改善足细胞转分化。本研究采用高糖刺激构建足细胞转分化模型，以miRNA-155为研究切入点，观察芪卫颗粒对足细胞转分化和miRNA-155的影响。结果发现高糖环境下足细胞中miRNA-155的表达水平明显升高，转分化相关指标nephrin的基因及蛋白表达水平明显下降，α-SMA基因及蛋白表达水平明显升高，提示高糖促进了足细胞转分化。经药物干预后，足细胞nephrin的蛋白和基因表达水平明显升高，α-SMA的基因和蛋白表达水平明显降低，且细胞活力明显升高，提示中药芪卫颗粒能够抑制足细胞转分化。miRNA-155基因敲减组足细胞转分化水平亦有所减轻(nephrin的表达水平明显升高，α-SMA的表达水平明显降低)，提示抑制miRNA-155的表达能改善足细胞转分化。另外，与高糖组相比较，芪卫颗粒干预后的足细胞miRNA-155的表达水平明显下降，提示芪卫颗粒能抑制高糖环境下足细胞中miRNA-155的表达水平。芪卫颗粒对高糖环境下足细胞转分化的作用效果与敲减miRNA-155的作用效果相似，故认为芪卫颗粒可以通过抑制miRNA-155减轻高糖诱导的足细胞转分化。但miR-155是否通过调控其相关靶基因表达水平促进足细胞转分化，及芪卫颗粒如何抑制足细胞中miRNA-155的表达，这些机制需要进一步深入探讨。

综上所述，芪卫颗粒能够明显减轻高糖诱导的足细胞转分化，其部分机制是通过抑制miRNA-155的表达水平实现的。