李超逸，李 龙，朱 莹，吴 婷，杜一平*

（华东理工大学 上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237）

硝酸盐与亚硝酸钠是常见的含氮化合物，广泛存在于人类生活环境中。人体内硝酸盐在微生物作用下可还原成亚硝酸钠，是N-亚硝基化合物的前体物质。亚硝酸钠的外观及滋味都与食盐相似，并在工业、建筑业中广为使用，在肉类制品中也允许作为发色剂限量使用。但是由亚硝酸钠引起食物中毒的机率较高。食入0.3～0.5 g的亚硝酸钠即可引起中毒，3 g可导致死亡[1]。GB 8537—2008《饮用天然矿泉水》规定了饮用天然矿泉水中亚硝酸钠质量浓度不得超过0.1 mg/L[2]。在食品工业中NO2－的添加量过多存在很大的食品安全问题[3-5]。摄入过量的亚硝酸钠能使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因而失去携氧能力而引起组织缺氧。同时，亚硝酸钠还是一种致癌物质，在胃酸环境下亚硝酸钠与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物N-亚硝胺。

目前亚硝酸钠的常用测定方法有离子色谱法、紫外分光光度法和可见分光光度法[6-12]。离子色谱法定量准确，但需要较昂贵的大型仪器，而且分析时间较长，不适用于快速、现场分析。紫外分光光度法虽然操作简单、分析速度快，但是灵敏度不高，容易受到其他物质的干扰。可见分光光度法虽然具有紫外光谱同样的优点，并且经过了衍生化试剂的衍生化，提高了抗干扰的能力，但是灵敏度依然不高。在GB 8538—2016《饮用天然矿泉水检验方法》[13]中饮用天然矿泉水规定了亚硝酸钠的标准检测方法为盐酸萘乙二胺分光光度法。亚硝酸钠与对氨基苯磺酸定量反应生成重氮盐，而重氮盐会与盐酸萘乙二胺发生偶联，反应产物呈紫红色，可用于亚硝酸钠的定量分析[14]。该方法适用于微量亚硝酸钠的检测，但达不到痕量亚硝酸钠的检测要求。本课题组曾开发了膜富集-在线漫反射光谱检测的装置和分析方法，称为固相萃取光谱（solid phase extraction spectroscopy，SPES）技术。该技术在被测组分富集后不经洗脱而在固相材料上直接测定固相光谱，方法简单、快速、灵敏，选择性往往也能得到提高[15-21]。本实验采用SPES技术，对亚硝酸钠的衍生产物富集后直接进行漫反射可见光谱的检测，大幅提高了检测方法的灵敏度，实现痕量亚硝酸钠含量的快速测定；所建立方法具备快速、便捷，仪器结构简单、操作方便、价格低廉的特点，适用于水质以及肉制品中亚硝酸钠离子的快速检测和现场检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美式培根和双汇培根 市购。

尼龙膜（Nylon-A）（孔径0.22 μm） 北京海成世洁过滤器材有限公司；混合纤维素膜（mixed cellulose ester，MCE）、尼龙膜（Nylon-B）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）、醋酸纤维素膜（cellulose acetate，CA）（孔径0.22 μm） 上海兴亚净化材料厂。

对氨基苯磺酸、氢氧化钠、三水合醋酸钠、冰醋酸（均为分析纯） 上海阿拉丁生化科技有限公司；亚硝酸钠、1-萘酚、浓盐酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

量筒式过滤器 天津津腾实验设备有限公司；PHS-25型数字型精密酸度计、AB104-N电子天平Mettler-Toledo（上海）仪器公司；超纯水净化系统（≥18.2 MΩ•cm） 德国Sartorius公司；超声波清洗器上海声彦超声仪有限公司；90-1型恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器公司；SHB-Ш循环水真空泵 上海卫凯仪器设备有限公司。

SPES采集系统由实验室自行搭建，部件包括：上海津腾实验设备有限公司的量筒式过滤器、BWTEK BIP2.0积分球、OCEAN-HDX-UV-VIS检测器（200～800 nm）、分辨率0.73、海洋光学紫外-可见光谱仪（带光纤）。

1.3 方法

1.3.1 实验原理

GB 8538—2016规定了盐酸萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸钠，反应产物为4-((4-(2-氨基乙基氨基)萘-1-基)二氮烯基)苯磺酸二盐酸盐，研究发现该偶氮化合物难以在微孔滤膜上富集，达不到SPES的要求。为此，本实验用1-萘酚代替盐酸萘乙二胺。先使用对氨基苯磺酸在酸性条件下与亚硝酸钠反应生成重氮盐（图1 1a），再与1-萘酚反应生成偶氮化合物[22]（图1 2a和2b），反应方程如图1所示。反应后的溶液过尼龙膜，尼龙膜截取偶氮化合物形成橘黄色色斑，干燥后直接对膜上的色斑进行漫反射可见光谱的测定。

图1 亚硝酸钠衍生化原理图Fig.1 Schematic diagram of sodium nitrite derivatization

1.3.2 标准方法

取10 mL一定质量浓度的亚硝酸钠溶液，根据比例加入对氨基苯磺酸，搅拌5 min后，按比例加入1-萘酚和缓冲溶液，搅拌15 min过后将溶液转移进100 mL容量瓶，加入缓冲溶液定容。取10 mL溶液，在尼龙膜固相萃取装置[15]上进行过滤，获得橘黄色的色斑，平行实验3 次，室温下自然风干干燥约40 min至无水分残留，采集滤膜色斑的可见光谱，用472.5 nm波长处吸光度与亚硝酸钠质量浓度建立标准曲线。

1.3.3 自来水中亚硝酸钠检测

取10 mL自来水（pH 4.3），加入不同体积的亚硝酸钠标准溶液，根据比例加入对氨基苯磺酸，搅拌5 min后，按比例加入1-萘酚和缓冲溶液，搅拌15 min后将溶液转移进100 mL容量瓶，加入缓冲溶液定容进行加标回收实验。取10 mL溶液，按上述方法进行光谱测定。

1.3.4 实际样品中亚硝酸钠检测

取2.5 g肉制品搅碎至肉糜，用60～70 ℃ 100 mL超纯水溶解并转移进250 mL容量瓶，沸水浴煮沸20 min，冷却至室温定容，分别使用0.1 μm的微孔滤膜和C18-SPE小柱进行处理得到肉制品提取液。取提取液5 mL，根据比例加入衍生化试剂和缓冲溶液，稀释至50 mL，按上述方法进行衍生化反应和光谱测定；离子色谱的对照实验也是使用该方法下获得的肉制品提取液直接进行分析。

2 结果与分析

2.1 衍生化反应产物的表征

对于衍生化产物，采用基质辅助激光解析-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）对其分子质量进行确定（图2），并用拉曼光谱对—N＝N—偶氮化合物骨架进行验证（图3）。质谱图中m/z327.1的谱峰，由于在负离子模式下，磺酸基的氢离子容易失去，与目标偶氮化合物2a或2b的分子质量（328.1 Da）相符；拉曼光谱中1 455.55 cm－1峰为—N＝N—骨架的特征峰[23]，该峰对应的偶氮化合物可能具有对位（2a）或邻位（2b）的取代结构。

图2 偶氮化合物的MALDI-TOF MS图Fig.2 MALDI-TOF MS of azo compounds

图3 偶氮化合物的拉曼光谱Fig.3 Raman spectrum of azo compounds

2.2 衍生化反应条件的优化

2.2.1 偶氮化合物溶液pH值的选择

pH值对偶氮化合物的结构以及合成有很大的影响[24-25]，酸性条件下1-萘酚上羟基的氢不易脱落，溶液呈现橙红色；碱性条件下羟基上的氢容易失去形成氧负离子，与萘环的大共轭π键相互作用，溶液呈现玫红色，同时碱性条件下的产物较复杂，副产物较多。因此，pH值的影响结果如图4所示，在pH 4.74时，膜上偶氮化合物获得最大的吸光度，后续选择pH 4.74的缓冲体系进行实验。

图4 样品溶液pH值对偶氮化合物吸光度的影响（472.5 nm）Fig.4 Effect of pH on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.2.2 反应时间的选择

亚硝酸钠和对氨基苯磺酸的重氮反应较为快速，常温下2～8 min即可反应完全[9]；但重氮盐和1-萘酚的反应程度则和反应时间有关。因此，设计实验考察3 个质量浓度的待测液，从加入衍生化试剂及缓冲溶液后开始实时监测溶液的吸光度，从而获得反应时间对吸光度的影响，平行3 次，如图5所示，随着反应时间延长，溶液吸光度逐步增高，到15 min吸光度恒定不变。后续实验中第2步反应时间选择15 min。

图5 反应时间对偶氮反应的影响（472.5 nm）Fig.5 Effect of reaction time on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.2.3 衍生化试剂用量比例的确定

参考文献[26]中亚硝酸钠-对氨基苯磺酸-1-萘酚的物质的量比1∶1∶1，但是，衍生化试剂比例的增加有利于亚硝酸根的反应以及偶氮化合物的合成。因此对亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、1-萘酚的比例进行优化。

由图6可知，当亚硝酸钠和对氨基苯磺酸用量比为1∶3时吸光度最高，误差较小，且有两条线在该处的吸光度相近，亚硝酸钠和1-萘酚比例1∶3和1∶7。考虑到节约试剂与保护环境的因素，后续实验选取亚硝酸钠和1-萘酚比例为1∶3。综合考虑，选择亚硝酸钠-对氨基苯磺酸-1-萘酚物质的量比为1∶3∶3。

图6 衍生化试剂用量的优化Fig.6 Optimization of the amount of derivatization reagent

2.3 膜富集实验条件优化

2.3.1 微孔滤膜种类的选择

按1.3.2节方法，使用2 mL质量浓度为8 mg/L亚硝酸钠溶液，经过反应过后，稀释至100 mL，取10 mL，分别过4 种常用微孔滤膜，即MCE、PVDF、Nylon、CA，考察富集偶氮化合物的性能。如图7所示，Nylon-A和Nylon-B两个厂家的尼龙膜对偶氮化合物有较好的富集效果，同时不同厂家的滤膜吸光度相差不大，但Nylon-B偏差较小。其他种类的膜材料或没有明显富集效果或光谱信号很弱。后续实验中选择Nylon-B对偶氮化合物进行富集。

图7 4 种滤膜富集偶氮化合物的对比图Fig.7 Comparison of enrichment of azo compounds using four kinds of filters

2.3.2 富集溶液体积的选择

设计实验考察20 μg/L、pH 4.74的亚硝酸钠衍生溶液，体积为1～20 mL范围内膜富集的效果。按照1.3.2节的方法进行富集、测试，结果如图8所示，随着样品体积从1 mL增加到7 mL，偶氮化合物472.5 nm波长处的吸光度明显增加。当样品体积从7 mL增加到15 mL时，偶氮化合物的吸光度增加不明显。同时，由于溶液体积位于15 mL和20 mL时，误差较大，故而选择溶液体积为10 mL为后续实验的样品溶液过膜体积。

图8 富集样品溶液体积对偶氮化合物吸光度的影响（472.5 nm）Fig.8 Effect of sample volume on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.4 漫反射光谱检测条件优化

亚硝酸钠溶液和对氨基苯磺酸和1-萘酚反应过后的酸性溶液先采用分光光度法测定其溶液特征峰，再富集到尼龙膜上测定漫反射光谱，2 种光谱图如图9所示，与文献[27-28]结果相符，后续实验选择472.5 nm为分析波长。

图9 偶氮化合物的分光光度光谱图与富集化合物的膜固相光谱图Fig.9 Diffuse reflectance spectra of free azo compounds and those enriched on the membrane

2.5 标准曲线和检出限

在优化好的条件下，通过富集系列质量浓度与衍生化试剂反应得到的偶氮化合物标准溶液，探究亚硝酸钠质量浓度在0.002～0.030 mg/L时与吸光度之间的关系。在0.002～0.030 mg/L质量浓度的范围内，富集产物的最大吸光度与亚硝酸钠质量浓度呈二次函数关系y=－268.76x2+14.55x+0.03，R2=0.999；在0.002～0.014 mg/L质量浓度范围内，富集产物的最大吸光度与亚硝酸钠质量浓度呈线性关系y=11.02x+0.03，R2=0.991。

利用9 次空白样品计算其标准偏差，按3 倍标准偏差估算得出本实验方法的检出限为1.29 μg/L，定量限为4.30 μg/L。

标准溶液的检出限为1.29 μg/L，根据自来水样品前处理的计算，自来水的方法检出限为12.90 μg/L，定量限为43.00 μg/L；根据培根样品前处理的计算，培根的方法检出限为1.29 mg/kg，定量限为4.30 mg/kg。

2.6 实际样品的检测结果

2.6.1 自来水中亚硝酸钠的检测

由于自来水中含有三价铁离子，三价铁离子容易和偶氮化合物的—N＝N—产生化学键合反应，4×10－6mol/L的三价铁离子会使偶氮化合物吸光度降低53.8%[26]，故而先将自来水pH值调节至4.3，再使用中性滤纸过滤，用过滤后的自来水按照1.3.3节的实验步骤进行反应，使用本方法未检测出亚硝酸钠，添加5.20、10.00、20.00 μg/L三种质量浓度的亚硝酸钠溶液进行加标回收实验，采集光谱数据进行分析，平行测定5 次。加标回收实验结果见表1。

表1 本方法对自来水中亚硝酸钠质量浓度的测定Table 1 Determination of NaNO2 concentration in tap water by the developed method

如表1所示，亚硝酸钠在自来水中的回收率在91.3%～114.0%的范围内，5 次平行实验的相对标准偏差在4.21%～7.90%之间。该结果能够满足日常分析的实验要求，证明了本研究使用的仪器和建立的方法在自来水中亚硝酸钠检测的准确性和实用性。

2.6.2 肉质品中亚硝酸钠的检测

肉质品选取从超市中购得的两种培根进行亚硝酸钠的检测，用文献的前处理方法[29]对样品进行处理，获得的培根提取液直接采取本实验方法检测；随后对获得的培根提取液进行离子色谱的检测，检测结果见表2。

表2 本方法与离子色谱检测2 种培根的结果Table 2 Determination of nitrite in two types of bacon by the developed method and ion chromatography

由表2可以看出，实际样品美式培根的亚硝酸钠含量为7.60 mg/kg，双汇培根的亚硝酸钠含量为7.96 mg/kg，均低于国标[30]的要求（0.15 g/kg），平行实验的相对标准偏差分别为8.51%、9.98%。该结果满足日常分析需求，同时，本实验方法相比于离子色谱这种大型精密仪器而言，在精密度和灵敏度不低于离子色谱的基础上，日常维护少、分析速度快、携带便捷，证明该方法在检测实际的肉制品中亚硝酸钠含量时方法的准确性和实用性。

3 结 论

本研究建立一种基于膜固相萃取-漫反射可见光谱法对水质和肉制品中痕量亚硝酸钠进行定量检测的方法。该方法对国标中使用的衍生化试剂进行优化，并且结合膜富集的技术，具有膜固相萃取的简便、快速、有机试剂使用少、灵敏度高、检出限低、仪器造价成本低等优势，实际样品中的痕量亚硝酸钠含量分析的结果较为准确，精密度也可以接受，研究方法为可见光谱应用于痕量物质的分析提供了可能。