沈金灿，黄昌雄，肖陈贵，吴章杰，赵凤娟，康海宁，岳振峰,*

（1.深圳海关食品检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；2.深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045）

松香是以松树的含油树脂为原料加工得到的非挥发性天然树脂，广泛应用于药品、食品包装材料、造纸、油漆涂料、油墨等领域[1]。松香酸和脱氢松香酸是松香的主要成分，其化学结构如图1所示，毒理学研究表明松香酸可导致人体肺泡上皮细胞溶解，脱氢松香酸对人体红细胞、多核白细胞有毒性作用[2]。松香具有良好的黏附性，曾被用于畜禽屠宰加工的二次脱毛工序。2009年，我国明令禁止在畜禽屠宰中使用松香脱毛，但畜禽屠宰加工时违法使用松香脱毛的现象依然时有报道。使用松香进行脱毛时，松香主要成分松香酸和脱氢松香酸，通过畜禽胴体表皮毛孔残留在表皮组织中[3]。消费者食用含有松香成分残留的食品，可能会对健康带来安全隐患。

图1 松香酸（A）及脱氢松香酸（B）的化学结构Fig.1 Chemical structures of abietic acid (A) and dehydrogenated abietic acid (B)

有关松香酸和脱氢松香酸的分析方法主要有薄层色谱[4]、气相色谱法[5-6]、气相色谱法-质谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-13]、液相色谱-质谱法[14-17]、酶联免疫吸附测定法[18-19]、飞行时间质谱法[20]等，分析的对象主要包括中药材、植物提取物、化妆品、动物表皮等。畜禽肉制品中松香残留的安全隐患已引起关注，张苏珍等[9-10]分别研究了鸭表皮组织中松香酸及脱氢枞酸的测定，在多个样本中检测出松香酸和脱氢枞酸；杜盼盼等[21]在部分生熟猪蹄（耳）制品检出脱氢松香酸。目前已报道的畜禽肉制品测定方法以液相色谱法为主[9-10,21]，方法灵敏度较低、抗干扰能力不强；并且方法仅针对松香酸或脱氢松香酸单个组分进行测定，难以对松香违规使用进行综合评判。液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、专属性强、分析速度快等优点[22-26]，适用于动物组织中痕量松香酸及脱氢松香酸的快速、准确分析。基于液相色谱-串联质谱法的畜禽组织中松香酸和脱氢松香酸的同时测定未见报道。本实验建立了畜禽表皮组织中松香酸和脱氢松香酸残留高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测方法，对市场上销售的鸭、鹅、猪头表皮中的松香酸和脱氢松香酸含量进行分析，并考察松香及松香甘油酯模拟脱毛鸭皮中的松香酸和脱氢松香酸残留，旨在为打击非法使用工业松香拔毛行为提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阴性和阳性样本，肉鸭购自深圳市农贸市场，宰杀后分别采用人工脱毛（阴性样本）、松香脱毛（阳性样本）及松香甘油酯脱毛（阳性样本）；实际分析用鸭、鹅、猪头皮样本分别来源于深圳地区超市和农贸市场，其中鸭、鹅为生肉制品，猪头皮为熟肉制品。所有样本取表皮组织，切碎，混合均匀，于－20 ℃保存。

松香酸标准品（纯度88.2%）、乙酸铵（色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司；脱氢松香酸标准品（纯度90%） 上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merk公司；实验用水均为Millipore纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

Milli-Q Integral 10纯水仪 美国Millipore公司；C18固相萃取小柱（200 mg，6 mL）、固相萃取装置美国Agilent公司；HLB固相萃取小柱（200 mg，6 mL）美国Waters公司；LCMS-8050液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 日本岛津公司；Reax Top旋涡振荡器 德国Heidolph公司；S90H超声波清洗仪 德国Elmasonic公司；3K18高速冷冻离心机德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液储备液、混合标准中间液以及工作溶液配制

分别称取适量松香酸和脱氢松香酸标准品，用甲醇溶解，配制100 mg/L的标准储备液。分别移取100 μL松香酸和250 μL脱氢松香酸标准储备液，用甲醇定容至10 mL，配制成混合标准中间液。采用空白样品提取液作为基质溶液配制系列标准溶液，标准溶液中松香酸的质量浓度为0、2、4、10、20、40、100 μg/L，脱氢松香酸的质量浓度为0、5、10、25、50、100、250 μg/L。

1.3.2 样品处理

称取2 g（准确至0.001 g）混合均匀的样品于15 mL离心管中，加入5 mL乙腈，旋涡振荡后超声波水浴振荡提取10 min，10 ℃、9 000 r/min离心5 min，取出上清液于10 mL容量瓶中；再加入4 mL乙腈，重复以上提取步骤，合并上清液，用乙腈定容至10 mL。准确吸取5.00 mL提取液，加入8 mL水混匀，通过HLB SPE小柱（预先用3 mL乙腈、3 mL水活化），用3 mL 40%体积分数乙腈溶液淋洗，抽干，最后用2.00 mL甲醇洗脱，洗脱液经0.22 μm微孔滤膜过滤，待HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Shim-park GIST C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流动相：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为0.1%甲酸-甲醇溶液；采用等度洗脱，0～5 min保持90% B；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。

1.3.4 质谱条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式；分辨率：单位分辨率；脱溶剂温度526 ℃；喷雾电压4.0 kV；离子传输管温度250 ℃；雾化器气流速3.0 L/min；干燥器气流速3.0 L/min；加热气流速15.0 L/min；接口温度300 ℃；加热块温度400 ℃；碰撞气：氩气；碰撞气压力270 kPa；在正离子监测模式下，分别对碰撞能量和选择离子等质谱参数进行优化，选取碰撞后所得丰度较高的2 个子离子作为特征离子，选择的离子对及对应参数见表1。

表1 松香酸和脱氢松香酸的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for abietic acid and dehydrogenated abietic acid

1.3.5 精密度及回收率实验

准确称取2 g混合均匀的阴性样品于15 mL离心管中，分别加入一定量的混合标准溶液，使得松香酸添加量为5、10、50 µg/kg，脱氢松香酸添加量为20、40、200 µg/kg，在室温下放置30 min。按照1.3.1节样本处理方法进行松香酸和脱氢松香酸的提取，最后用HPLC-MS/MS仪进行测定，以测定的化合物含量和添加量的比值计算回收率。

2 结果与分析

2.1 质谱及色谱条件优化

松香酸和脱氢松香酸均为有机酸，质谱分析常采用电喷雾负离子进行检测[16]。然而实验发现，采用电喷雾负离子进行检测时，虽然母离子有较强信号，却无法得到有效的碎片离子，因而最终无法采用质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行检测，难以进行灵敏、准确测定，因此实验尝试用电喷雾正离子进行检测。以500 µg/L的松香酸和脱氢松香酸标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定松香酸和脱氢松香酸的[M+H]+离子峰分别为m/z303和301；然后分别以这些离子作为母离子，对其子离子进行全扫描，其二级质谱图见图2、3。松香酸主要产生m/z123、257、135、149等子离子；脱氢松香酸要产生m/z173、133、255、131等子离子。选取丰度最强的2 对离子作为各组分的监测离子，优化喷雾电压、碰撞能量、脱溶剂温度等质谱参数，最终参数见表1。

图2 松香酸的二级质谱图Fig.2 Secondary mass spectrum of abietic acid

色谱分离时，采用甲醇、水作为流动相，考虑到松香酸和脱氢松香酸的质谱检测采用正离子，加入一定的甲酸，有助于促进松香酸电离从而有利于离子化，因此在流动相中均加入了0.1%甲酸。通过优化分离条件，采用等度洗脱程序进行分离，5 min内实现了松香酸和脱氢松香酸的快速分离和检测。

图3 脱氢松香酸的二级质谱图Fig.3 Secondary mass spectrum of dehydrogenated abietic acid

2.2 样品提取及净化

松香酸是一种三环二萜类含氧化合物，脱氢松香酸为松香酸分子脱去2 个氢原子并发生双键重排后的产物，这2 种化合物均易溶于有机溶剂，乙腈是常用的提取溶剂[9-12,21]。为此，样品的提取参考张苏珍[9-10]、杜盼盼[21]等的方法，采用乙腈作为提取液，提取后的样品溶液采用固相萃取柱进行净化。由于松香酸和脱氢松香酸在反相色谱上有较好的保留，因此可以用C18或HLB固相萃取柱进行净化[9-11]。实验分别采用C18和HLB固相萃取柱对添加了松香酸和脱氢松香酸的样品提取液进行净化，发现C18或HLB固相萃取柱对于松香酸和脱氢松香酸的回收率均在90%以上，最终采用HLB固相萃取柱进行净化。为了尽量去除杂质，考察20%～60%乙腈溶液作为淋洗液对回收率的影响，结果如图4所示。当乙腈体积分数超过40%以后，松香酸和脱氢松香酸的回收率开始明显下降，表明部分松香酸和脱氢松香酸被洗脱下来，因此最终采用40%乙腈溶液作为淋洗液。

图4 淋洗液对回收率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of acetonitrile as washing solutions on recovery rates

2.3 线性范围、检出限及定量限

在本方法所确定的实验条件下，取一系列标准溶液，以峰面积（Y轴）对相应的质量浓度（X轴）作图，松香酸和脱氢松香酸质量浓度与对应的峰面积值呈现良好的线性关系。检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分别在定性离子色谱峰可有效识别的前提下，以实际样品和低水平加标样品各分析物的信噪比分别约为3和10进行评估[27]，结果见表2。松香酸的LOD和LOQ分别为1.1 µg/kg和3.6 µg/kg，脱氢松香酸的LOD和LOQ分别为3.9 µg/kg和13 µg/kg。与已报道的液相色谱法[9-10]相比较，本方法对松香酸的灵敏度提高了约90 倍，对脱氢松香酸的灵敏度提高了约25 倍。

表2 松香酸和脱氢松香酸的回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 2Regression equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of abietic acid and dehydrogenated abietic acid

2.4 回收率实验

在鸭皮、鹅皮和猪头皮空白样品中分别添加5、10、50 μg/kg的松香酸和20、40、200 μg/kg的脱氢松香酸的混合标准溶液，按1.3节方法进行处理和测定。由图5可知，松香酸的保留时间为3.37 min，2 对离子的丰度比为100∶43；脱氢松香酸的保留时间为2.49 min，2 对离子的丰度比为100∶94。鸭皮、鹅皮和猪头皮中松香酸和脱氢松香酸添加回收率如表3所示，在添加量范围内，松香酸的回收率为84.8%～93.7%，脱氢松香酸的回收率为81.7%～91.8%，相对标准偏差均在12%以内。张苏珍等[9-10]采用液相色谱法分别测定了肉鸭表皮中的松香酸及脱氢松香酸，松香酸的回收率为82.2%～88.0%，脱氢松香酸的回收率为80.8%～91.8%，本方法的回收率与其基本一致。

表3 不同加标样品中松香酸和脱氢松香酸的回收率及精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and precision of abietic acid and dehydrogenated abietic acid in different spiked samples (n= 6)

图5 鸭皮添加5 μg/kg的松香酸（A）和20 μg/kg的脱氢松香酸（B）的MRM图Fig.5 MRM chromatograms of duck skin spiked with 5 μg/kg abietic acid (A) and 20 μg/kg dehydrogenated abietic acid (B)

2.5 实际样品分析

应用本方法检测购自本地超市或农贸市场的5 份肉鸭、5 肉鹅和5 份猪头皮进行检测，在其中7 份样品中检出松香酸和脱氢松香酸残留，样品检出率为47%；松香酸的最高值为7.39 μg/kg，脱氢松香酸的最高值为0.830 μg/kg，结果见表4。

表4 实际样品中松香酸和脱氢松香酸含量Table 4 Contents of abietic acid and dehydrogenated abietic acid in actual samples

本研究还考察了松香及松香甘油酯模拟脱毛肉鸭表皮中的松香酸及脱氢松香酸的残留情况，测得松香脱毛鸭皮中松香酸含量为17.5 mg/kg，脱氢松香酸含量为2.04 mg/kg；松香甘油酯脱毛鸭皮中松香酸含量为0.692 mg/kg，脱氢松香酸含量为0.658 mg/kg。松香甘油酯是允许使用的脱毛剂，但结果表明即使使用松香甘油酯进行脱毛，也会有痕量的松香酸和脱氢松香酸残留。这主要在于，松香甘油酯生产是由松香酸和过量甘油三酯直接混合进行酯化反应制得[28-30]，由于无法达到100%完全反应，故其最终产品中含有少量松香酸和脱氢松香酸，脱毛时会残留于鸭皮表面。实验进一步检测松香甘油酯及松香样品，发现松香甘油酯中松香酸质量分数为0.52%，脱氢松香酸质量分数为0.45%；而松香中松香酸质量分数为31%，脱氢松香酸质量分数为3.6%。可以看出，松香中松香酸和脱氢松香酸含量差异大，而松香甘油酯中松香酸和脱氢松香酸含量较为接近，这是由于松香在酯化反应过程中松香酸与脱氢松香酸并非等比例消耗，从而改变了松香甘油酯中残余的松香酸和脱氢松香酸的比值。虽然采用松香甘油酯进行脱毛也会有痕量的松香酸和脱氢松香酸残留，但是其残留量明显较松香脱毛低得多；并且采用松香甘油酯脱毛鸭皮中松香酸和脱氢松香酸的比值与松香脱毛鸭皮样品存在明显差异，松香脱毛松香酸和脱氢松香酸比值接近9，与松香中这2 种化合物的比值一致；而采用松香甘油酯脱毛松香酸和脱氢松香酸比值接近1，也与松香甘油酯中这2 种化合物的比值基本一致；这种比值的差异可以用于辅助判定违规采用松香进行脱毛。从实际样品的检出情况可知，肉鸭1、肉鸭3、肉鹅3和猪头皮1的检测结果与松香脱毛的结果较为一致，而肉鸭5、肉鹅1及猪头皮4与松香甘油酯脱毛的结果较为一致。该实验也表明，仅通过测定松香酸或脱氢松香酸单种组分判定违规使用松香脱毛存在较大的风险，因为采用松香甘油酯脱毛动物表皮组织中松香酸或脱氢松香酸也会有一定的残留，需要同时测定两种组分进行综合判定更为可靠。

3 结 论

本实验建立了畜禽动物表皮中松香酸和脱氢松香酸含量的液相色谱-串联质谱分析方法，样品中的松香酸和脱氢松香酸经乙腈超声提取、HLB SPE固相萃取柱净化，然后采用含甲酸的水及甲醇作为流动相、在C18反相柱上进行分离，用三重四极杆串联质谱进行检测。与传统的固相萃取柱萃取-液相色谱法相比，该方法更为灵敏、可靠，且能够同时测定松香酸和脱氢松香酸。方法对多个市售鸭、鹅、猪等畜禽样品表皮组织进行检测，松香酸和脱氢松香酸的检出率为47%；模拟脱毛实验的研究表明采用松香甘油酯脱毛也会导致一定的松香酸和脱氢松香酸残留。该方法有助于为打击非法使用工业松香拔毛行为提供技术支持，具有实际应用价值。