方贤胜，吴 涛，肖良俊*

（云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201）

核桃（Juglansspp.）是世界四大干果之一[1]，核桃仁是核桃食用部位，其富含蛋白质、脂肪、磷脂、维生素、矿物质等营养成分[2]。核桃又是我国药典收载的中药，是典型的药食同源食品[1]。其药用功效多与富含的多酚和黄酮成分有关，这些物质具有抗氧化、提高免疫力等多方面的功效，是近年研发的热点[3]。核桃仁由胚（种仁或核仁）和内种皮（仁膜）组成，核桃内种皮为包裹在核仁表面的一层薄膜[4-5]，一般呈浅黄色，也有特异品种、资源呈紫色[6]或鲜红色[7]。许多研究表明核桃仁多酚和黄酮主要集中在内种皮上[8-9]，抗氧化及抑酶活性显著，适宜进行抗衰老等保健产品的开发[3]。本实验组在开展云南省核桃种质资源调查过程中，发现28 份内种皮紫色的核桃，口感较好，食味香纯，已对其氨基酸[10-11]、脂肪酸[12]和矿质元素[13]进行比较分析。水果的果皮颜色和果肉颜色是消费者偏好和适销性的重要决定因素，不仅因为视觉效应，还因为紫色或红色外表更能让人主观上觉得其含有特别的或更多的有益健康成分。比如，核桃内种皮是核桃酚类物质的重要来源，内种皮酚类物质含量是核仁的8 倍[14]，其咖啡酸和香豆酸含量约是核仁的15 倍和752 倍[8]。由于许多有益的酸、单宁和类黄酮存在于果皮或种皮中，紫皮核桃是否含有浅黄色核桃中没有的营养成分或营养成分更高，尚缺乏相关信息。

代谢组学是系统生物学的重要组成部分[15-16]。代谢组学技术通过高通量化学分析技术对生物样品中的小分子代谢产物进行定性和定量分析，在营养科学[17]、疾病诊断[18]、毒理学[19]、植物代谢和响应机理[20]等方面广泛应用。Wang Dandan等[21]基于广泛靶向代谢组学技术对黑芝麻中的营养成分及其在中药中发挥作用的相关代谢物进行了鉴定。Ho等[22]用代谢组学技术从黑核桃（J.nigra）中鉴定了6 个具有抑菌活性的化合物。运用代谢组学方法分析不同颜色的核桃内种皮中的代谢成分及其差异尚鲜见报道。本研究以普通浅黄色和特异紫色2 种颜色的核桃内种皮为研究材料，利用广泛向代谢组学方法，应用超高效液相色谱-串联质谱技术，检测2 种材料的代谢物种类，并对其差异性进行比较分析，从差异代谢物的角度着手，揭示其多酚、黄酮物质组成及内种皮颜色差异，旨在为核桃内种皮中化学物质表征和功能成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以云南省香格里拉市三坝乡哈巴村25 a生的紫皮核桃（J.sigillatacv.‘Ziyi’）和漾濞泡核桃（J.sigillatacv.‘Yangpao’）的果实为供试材料，所取试材的生境和栽培管理措施一致。核桃果实成熟时从植株的东、西、南、北4 个方向各采集50 个核桃青果带回实验室。去除核桃青皮和种壳，剥取新鲜核桃仁的内种皮。漾濞泡核桃的内种皮为浅黄色，紫皮核桃的内种皮为紫色，其表型颜色见图1。2 种颜色的内种皮材料各用5 mL冻存管取3 个重复，然后迅速置于液氮中，随后转移至－80 ℃超低温冰箱中保存备用。

图1 漾濞泡核桃（A）和紫皮核桃（B）内种皮颜色Fig.1 Endocarps of J.sigillata cv.‘Yangpao’ (A) and J.sigillata cv.‘Ziyi’ (B)

甲醇、乙腈、乙醇、标准品（均为色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

MM400研磨仪 德国Retsch公司；7754070冷冻干燥机 美国Labconco公司；5430R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Shim-pack UFLC CBM30A超高效液相色谱仪 日本岛津公司；QTRAP 6500系统串联质谱仪 美国赛默飞世尔公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

对超低温冷冻保存的2 组供试样品进行真空冷冻干燥，用研磨仪研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末状；准确称取100 mg粉末，用1 mL 70%甲醇溶液提取；提取液于4 ℃冰箱过夜，期间涡旋3 次，提高提取率；12 000 r/min离心，吸取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.3.2 超高效液相色谱-串联质谱分析

色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：A相为超纯水（加0.04%乙酸），B相为乙腈（加0.04%乙酸）；梯度洗脱：0～11 min，95%～5% A、5%～95% B；11～12 min，5% A、95% B；12～15 min，5%～95% A、95%～5% B；15～18 min，95% A、5% B；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

流出物交替连接到电喷雾离子源-三重四极杆条件：电喷雾离子源温度500 ℃，质谱电压5 500 V，气体I和气体II压力分别设置为55 psi和60 psi，气帘气压力25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。碰撞气体（氮气）压力为5 psi进行多反应监测（multiple reaction monitor，MRM）实验，获得三重四极杆扫描结果，在三重四极杆中，每个离子对MRM是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.3.3 质控样本

质控样本由2 组不同颜色核桃内种皮提取物等量混合制备而成，3 个重复，与分析样本采用相同的方法处理和检测，在仪器检测的过程中，每10 个检测分析样本中插入1 个质控样本，以考察整个分析过程的重复性。

1.4 数据分析

基于迈维（武汉）生物技术有限公司自建MVDB V2.0数据库及代谢物信息公共数据库根据二级谱信息进行物质定性，代谢物定量是利用三重四极质谱MRM分析完成。获得不同样本的代谢物质谱并对物质质谱峰进行峰面积积分，进行同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[23]，利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。采用多元统计分析，对两组样本进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析，根据偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）法预测模型稳定可靠性。利用多维统计变量重要性投影（variable importance in project， VIP）值、单维统计P值及差异倍数筛选差异代谢物。通过R（v3.3.2）中pheatmap程序对筛选出的浅黄色和紫色核桃内种皮差异代谢成分进行聚类分析并绘制热图。对各组样本差异代谢物进行层次聚类选，同时将得到的相应差异代谢物提交到KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库网站，进行相关通路分析。

2 结果与分析

2.1 代谢组成分总体分析

基于迈维（武汉）自建代谢物数据库及相关质谱数据库，对MRM代谢物检测多峰图，通过三重四极杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，对主要代谢物进行定性和定量分析。在浅黄色和紫色核桃内种皮中，鉴定出23 类680 种代谢物（表1），其中浅黄色核桃内种皮的代谢组成分有23 类670 种，特有的化学物质有7 类12 种；紫色核桃内种皮的代谢组成分有23 类668 种，特有的化学物质有6 类10 种。

表1 浅黄色和紫色核桃内种皮中的代谢物数量统计Table 1Statistics of metabolites in yellowish and purple walnut endocarps

2.2 浅黄色和紫色核桃内种皮代谢组学差异分析

2.2.1 PCA结果

通过对样本进行PCA，判别浅黄色和紫色核桃内种皮各组样本之间的分组之间和组内样本之间的变异度大小。结果得到5 个主成分，其中PC1的贡献率为63.15%，PC2的贡献率为10.84%，且两组样本在二维图上表现出明显的分离趋势（图2），组内之间浅黄色内种皮的分离大于紫色内种皮，在PCA结果上能够从总体上反映出两组样品之间的代谢物差异。

图2 两组样品及质控的PCA结果Fig.2 PCA plot for discrimination of two groups of samples and quality control

2.2.2 OPLS-DA结果

PCA法虽然能够有效地提取主要信息，但是对于相关性较小的变量不敏感，而PLS-DA可以使组间区分最大化，有利于寻找差异代谢物。OPLS-DA结合了正交信号矫正和PLS-DA方法，通过去除不相关的差异筛选差异变量。根据OPLS-DA模型（图3a）对680 种代谢组数据进行分析，浅黄色核桃内种皮样品分布在置信区间的左侧，紫色核桃内种皮样品分布在置信区间的右侧，2 个样品的区分效果丰常明显。OPLS-DA得到PC1的贡献率为62.1%、PC2的贡献率为9.74%，=0.719，=0.999、Q2=0.975，其中Q2＞0.9为出色的模型，相比于PCA模型效果更好。对OPLS-DA进行排列验证（n=200，即进行200 次排列实验）。在模型验证中（图3b），横线对应为原始模型的和Q2，红点和蓝点分别代表Y置换后模型的和Q’2。和Q’2均小于原始模型的和Q2，即相应点都不超过相应的线，则说明模型有意义，可根据VIP值分析筛选其差异代谢物。

图3 OPLS-DA得分图（a）和验证图（b）Fig.3 OPLS-DA score plot (a) and verification (b) of OPLS-DA model

2.2.3 差异代谢物鉴定

基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的VIP值，以其表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP≥1的代谢物则为差异显著。初步筛选出两类样品间差异的代谢物，选取VIP≥1的代谢物。浅黄色与紫色核桃内种皮进行筛选共得到的差异代谢物21 类244 种（表1）。整体上浅黄色与紫色核桃内种皮差异代谢成分（244 种）占共有代谢成分（658 种）的37.08%，说明不同颜色的核桃内种皮代谢物质差异显著。其中差异较大的是有机酸及衍生物、黄酮、苯丙素、氨基酸及衍生物、黄酮醇5 种类别，分别占比为19.26%、13.11%、9.42%、8.20%和7.38%。

2.3 差异性代谢产物分析

2.3.1 差异代谢物热图分析

为方便观察代谢物变化规律，对差异显著的代谢物进行归一化处理，并绘制聚类热图，结果如图4所示。该图简单、直观地反映出代谢物的变化情况。在244 种差异代谢成分中，紫色核桃内种皮相对浅黄色核桃内种皮有93 种成分上调，即相对含量增加，增加的代谢成分占244 种差异代谢成分的38.11%，151 种成分下调，即相对含量降低，降低的代谢成分占244 种差异代谢成分的61.89%。

图4 差异代谢物热图Fig.4 Heat map for differential metabolites

2.3.2 主要差异代谢成分分析

比较浅黄色和紫色核桃内种皮样品中代谢成分定量信息发生的差异倍数变化，将差异倍数进行处理（log2FC），变化排在前的20 个差异表达代谢成分如图5所示。与浅黄色核桃内种皮相比，紫色核桃内种皮5 种有机酸及衍生物（3-O-阿魏酰奎宁酸、奎宁酸O-二葡萄糖醛酸、隐绿原酸、新绿原酸、1-咖啡酰奎宁酸），1 种苯丙素（6-羟基-4-甲基香豆素），1 种维生素及衍生物（抗坏血酸），1 种黄酮（木犀草素C-阿魏酰基己糖苷），1 种生物碱（N-甲基色胺），1 种氨基酸及衍生物（Nα-乙酰-L-精氨酸）的相对含量显著增加；2 种原花青素（原花青素B2、原花青素B3），1 种黄酮（氧甲基柚皮素C-戊糖苷），1 种黄酮醇（紫杉叶素），1 种黄酮类（水仙苷），1 种多酚（儿茶素），1 种生物碱（5-甲氧基-N,N-二甲基色胺），1 种有机酸及衍生物（龙胆酸），1 种醇类（去氢催吐萝芙木醇），1 种苯丙素（芥子酰羟基香豆素）的相对含量显著降低。紫杉叶素（二氢槲皮素）属于黄酮醇，在浅黄色核桃内种皮中的含量是紫色的137.83 倍。资料显示，其对癌症和皮肤衰老具有治疗前景，可以清除髓过氧化物酶衍生的活性氮，减轻（谷胱甘肽合成的不可逆抑制剂）丁硫氨酸亚砜胺对人皮肤组织的损伤，下调UVB处理皮肤细胞中的胶原酶I[24]。

图5 2 个样品中含量差异最大的20 种代谢物Fig.5 Twenty most significantly differential metabolites between two samples

2.3.3 差异代谢物通路分析

通过KEGG数据库对差异代谢物质进行通路富集分析结果（图6）显示，鉴定出的244 种显著差异代谢物，主要分布在20 条代谢途径中，差异代谢物数量富集最多的前5 条通路：1）次生代谢产物的生物合成通路，主要包括氨基酸及衍生物、核苷酸及衍生物、维生素及衍生物、吲哚及衍生物、有机酸及衍生物等90 种代谢成分；2）黄酮类生物合成通路，主要包括金圣草黄素5-O-己糖苷等48 种代谢成分；3）黄酮和黄酮生物合成通路，主要包括18 种黄酮醇类、7 种黄酮类、8 种黄烷酮、4 种异黄酮等37 种代谢成分；4）不同环境中微生物相关的代谢通路，主要包括30 种代谢成分；5）苯丙烷生物合成通路，主要包括芥子酰羟基香豆素等23 种代谢成分。前5 条通路分别是次生代谢产物生物合成通路、黄酮类生物合成通路、黄酮和黄酮醇生物合成通路、环境微生物相关代谢通路和苯丙烷生物合成通路，分别包括代谢物90 种（36.89%）、48 种（19.67%）、37 种（15.16%）、30 种（12.30%）和23 种（9.43%）。

图6 差异代谢物KEGG富集图Fig.6 KEGG enrichment map for differential metabolites

3 讨 论

本研究采用广泛靶向代谢组学技术，以浅黄色和紫色核桃内种皮为材料，对二者的代谢物进行对比分析。从2 种类型的核桃内种皮中检测到23 类680 种代谢物，其中差异代谢成分（21 类244 种）占共有代谢成分（23 类658 种）的37.08%。核桃内种皮相对于外种皮（核桃壳）来说，物理保护屏障功能较弱，但无疑其对核桃仁具有很强的化学保护和防御功能。防护功能主要源于含量较高各种植物化学物质，如杏和甜樱桃积累了大量的生氰糖苷[25]，但多数物种的种子受到高含量硫代葡萄糖苷、生物碱或酚类化合物的保护[26]。核桃内种皮中高含量酚类化合物的作用是保护富含脂肪的油性胚乳的种胚，这种保护并不侧重于防御掠食者，因为核桃仁被包裹在坚硬的外壳中，外壳上覆盖着高含量酚类的青皮[27-28]。在这种情况下，酚类化合物的抗氧化性潜在地负责保护核桃仁免受有价值的脂肪酸的氧化，从而保护核桃仁的内在质量。

核桃仁略有的苦涩味与其含有的酚类化合物有关[29]，且在内种皮中的含量远高于核仁[14]。虽然酚类化合物没有已知的营养功能，但由于其良好的抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎和抗突变特性，它们对人体健康有重要作用[3]。黄酮类和多酚类物质结构复杂，种类多样，具有镇痛、护肝、抗脑缺血损伤、抗心律失常、抗自由基和抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性和药理作用[4]。紫色核桃与浅黄色核桃相比，共有的25 种黄酮差异代谢物中上调的物质（即在紫色核桃中相对含量较高）有10 种，平均差异倍数4.96 倍，下调的15 种差异代谢物的平均差异倍数0.29 倍；多酚类差异代谢物有11 种，其中二没食子儿茶素为上调代谢物质，差异倍数为2.36 倍，另10 种为下调物质，平均差异倍数为0.20 倍。

核桃核仁颜色是影响核桃坚果质量分级和销售价格的因素。在GB/T 20398—2006《核桃坚果质量等级》中，核桃坚果分为4 级，特级、I级和II级的核仁颜色都要求黄白，III级为黄白或浅琥珀色[30]。在LY/T 3004—2018《核桃标准综合体》中，核桃坚果分为3 个等级，特级和一级的核仁颜色都要求“黄白或具良种特有颜色”，二级为“黄白、浅琥珀色或具良种特有颜色”。另一方面，由于（紫）红色在中国和其他亚洲国家是一个卖点，因为它象征幸福和好运，因而售价更高。研究表明，菜豆和拟南芥种膜的颜色是由苯丙烷类化合物的氧化决定的[31-32]。所有陆地植物都会合成苯丙烷，这是一类包括单宁、花青素、黑色素、木质素的化合物。这些化合物中有许多是有色的，赋予植物着色和抗氧化保护作用[33-34]。浅黄色和紫色核桃内种皮共测得花青素类物质13 种、原花青素类物质4 种，通过对花青素类和原花青素类差异代谢物进行鉴定，得到花青素类差异代谢物8 种，原花青素类差异代谢物3 种。紫色核桃内种皮相对于浅黄色核桃内种皮在芍药花青素O-己糖苷、矢车菊属3-O-丙二酰己糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素半乳糖苷、芍药3-O-葡萄糖苷氯化物5 种的含量较高（4.10 倍），矢车菊素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡糖苷、矢车菊素3-O-芸香糖苷3 种含量较低（0.33 倍）。在3 种原花青素类差异代谢物中，紫色核桃内种皮相对于浅黄色核桃内种皮原花青素A、原花青素B2、原花青素B3的含量均较低（0.14 倍）。总体而言，紫色核桃内种皮花青素差异代谢物中含量较高的代谢物的数量较多且差异倍数较大，含量较低的代谢物少且差异倍数较小，内种皮中花青素积累的差异可能是影响核仁颜色差异的因素之一。

2 种核桃内种皮相较对方而言，各自特有代谢物质共22 种，占全部代谢物质（680 种）的3.24%。通过文献检索和化学物质数据库检索，22 种特有代谢物质中有相关功能报道的仅1 种苯丙素（花椒毒醇）和3 种生物碱（植保素、茶碱和咖啡碱）。花椒毒醇具有生物活性的线性呋喃香豆素，有强烈的药理学活性，如抗炎、抗氧化，5-羟色胺拮抗和神经保护作用。植保素是一种简单的吲哚生物碱，存在于拟南芥和其他十字花科植物中，其次生代谢产物起植物抗毒素的作用，可以阻止细菌和真菌病原体。茶碱对哮喘和心肺疾病有疗效[35-36]。咖啡碱可能是世界上最常摄入的药理活性物质。它存在于咖啡、茶、可可等产品以及药物中，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏[37]。本研究对浅黄色和紫色核桃内种皮代谢物进行比较，所检测到的物质可为核桃内种皮的功能研究及下一步开发利用提供参考。