苏 丹，黄刚骅，李亚莉，任洪涛，包云秀，周红杰,*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学香料研究所，云南 昆明 650201；4.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666200）

茶叶的香气物质来源大致分为3 类。一类来自于茶叶品种本身[1]，在茶鲜叶生长过程中形成[2]，如紫娟品种的独特香气；另一类香气是茶叶在制造过程中一系列化学变化产生的效应产物，这些物质使茶叶的香气更加丰富[3]，如：不同的黑茶由于作用微生物的不同而有不同的香气特征，普洱熟茶的陈香[4-5]、六堡茶的槟榔香[6-8]、茯砖茶的菌花香[9]等；第3类香气是耐贮藏型茶叶在科学贮藏的过程中发展而成的，此种茶叶的第1类和第2类香气物质会在贮藏过程中发生新的化学变化，使香气更加醇厚，如普洱生茶经陈化由清香、花香逐渐向陈香递变[10-11]。

紫娟是云南大叶群体种中的一种高花青素茶树品种[12]，具有良好的抗氧化活性和抗炎活性[13-14]。目前，关于紫娟茶香气的研究主要集中在成茶香气成分分析[15-19]，对紫娟（熟茶）香气物质在加工过程中的动态变化方面尚待探明。本研究采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术对紫娟（熟茶）7 个人工发酵阶段样进行挥发性成分分析，探明紫娟（熟茶）不同发酵阶段挥发性香气组分及香气特征的动态变化，旨在为进一步探明紫娟（熟茶）发酵风味香与微生物之间的代谢关系提供理论依据，同时为紫娟（熟茶）微生物定向发酵、精准提升发酵茶产品质量、提高发酵过程生物安全保障及发酵茶叶风味多元化开发提供基础数据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料来自云南省西双版纳傣族自治州勐海县。采集同一批从原料入堆（0 d）到发酵结束（42 d）的紫娟（熟茶）加工阶段样：F0：紫娟晒青茶（0 d）；F1：第1翻（7 d）；F2：第2翻（14 d）；F3：第3翻（21 d）；F4：第4翻（28 d）；F5：第5翻（35 d）；F6：出堆（42 d）。

1.2 仪器与设备

CTC自动进样器、HP 7890A-5975C型GC-MS联用仪、HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取头 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME条件

称取磨碎均匀茶样1.00 g（精确至0.001 g），放入20 mL顶空瓶中，加入1.00 µg癸酸乙酯作为内标，对样品的质量进行监控和对比，加入5 mL沸水，密封瓶口孵化。将CTC自动进样器于60 ℃条件下稳定10 min，保证进样稳定性；并采用65 μm PDMS/DVB萃取头，在250 r/min、60 ℃条件下孵化50 min，所有样品重复3 次，进行数据采集。

1.3.2 GC-MS联用分析条件

以氦气（He，纯度＞99.999%）为载气。HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm），不分流进样，进样口温度230 ℃，脱吸附时间5 min；升温程序：初始温度50 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z35～500。

1.3.3 感官审评

依据GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》，按照初制茶审评因子从外形（A）、汤色（B）、香气（C）、滋味（D）和叶底（E）“五项因子”进行，茶汤制备方法参照黑茶（散茶）；品质评定的综合评分（Y）按百分制采用权数法：Y＝A×20%+B×15%+C×25%+D×30%+E×10%。

1.4 数据处理

根据GC-MS分析得到色谱峰，色谱峰总离子流图通过谱库检索（Wiley和NIST库），根据相对保留指数，取相似指数大于80为有效数据，并结合相关文献保留指数进行人工定性解析。对所有的相对峰面积数据进行标准化处理，依据各香气成分峰面积归一化的方法确定其相对含量。数据采用Origin Pro 20.0及Excel软件（Excel 2016）处理。

2 结果与分析

2.1 紫娟（熟茶）发酵阶段挥发性成分的定性及含量分析

紫娟（熟茶）发酵过程中，共计定性鉴定出92 种已知挥发性成分（表1），根据主要官能团的差异，可分为7 类（图1）：醇类、酮类、醛类、碳氢化合物、酸类、酚醚类和含氧杂环化合物。其中，碳氢化合物的种类最多（54 种），以烃、烯、烷、萘及其衍生物为主，酮类（11 种）、酚醚类（7 种）、醇类（7 种）、醛类（7 种）和含氧杂环化合物（5 种）的种类次之，最少的是酸类（1 种）。

图1 挥发性成分分类Fig.1 Classification of volatile components identified

表1 挥发性成分及其相对含量Table 1Volatile components identified from tea samples and their relative contents

续表1

紫娟晒青茶挥发性成分相对含量为94.90%，共7 类56 种：醇类5 种，酮类5 种，醛类5 种，碳氢化合物37 种，酸类1 种，酚醚类2 种，含氧杂环化合物1 种。7、14、21、28、35 d和42 d，分别检测出7 类64 种（97.86%）、7 类55 种（90.60%）、7 类46 种（93.06%）、7 类52 种（95.64%）、7 类60 种（94.66%）、7 类51 种（92.83%）。黑茶发酵过程中微生物胞外酶与底物相作用，促使底物发生转化、降解、聚合或产生异构体，从而形成不同的挥发性成分[20]。随着发酵的进行，碳氢化合物大部分从C15～C20的烃、烯、烷、萘及其衍生物成为C8～C15的碳氢化合物，研究表明，碳氢化合物越高级香气越浓、在C8～C15之间香气最强[21]。

2.2 紫娟（熟茶）发酵过程中挥发性成分变化

2.2.1 不同发酵阶段挥发性成分变化

茶鲜叶中挥发性物质的种类相对较少，但制茶过程产物对茶香形成具有重要作用[20]。通过自然渥堆发酵，微生物与湿热条件使紫娟晒青的挥发性香气组分发生复杂的变化，形成紫娟（熟茶）独特的风味特征。对应表1编号结合图2进行分析。

图2 紫娟（熟茶）发酵过程中挥发性成分动态变化Fig.2 Dynamic changes of volatile components in ripe Zijuan tea during fermentation

醛类：(E,E)-2,4-壬二烯醛、β-环柠檬醛、β-环柠檬醛混合物、异环柠檬醛、藏花醛几乎存在于整个发酵过程，发酵结束(E,E)-2,4-壬二烯醛（4.60%）、β-环柠檬醛混合物（0.30%）、藏花醛（0.46%）的相对含量均低于紫娟晒青。苯甲醛、壬醛、异环柠檬醛存在发酵中间过程，可能是形成其他香气组分的中间体。

碳氢化合物：发酵过程中，碳氢化合物具有种类多、含量微的特点，随着发酵时间的延长，碳氢化合物的种类逐渐减少、单个物质相对含量逐渐增加，其中，D-柠檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、(－)-氧化石竹烯、甜没药烯、长叶烯、δ-杜松烯、2,2,6,9-四甲基三环[8.1.0.01.6]十一烷-8-烯、2-环己基辛烷、十二烷、2-甲基十二烷、2,6,11-三甲基十二烷、5-丙基十三烷、环十四烷、3-甲基十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、2-甲基十八烷、二十烷、姥鲛烷、萘、1-甲基萘、2,6-二甲基萘、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘及1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘在发酵过程中含量丰富。

含氧杂环化合物：反式芳樟醇氧化物（呋喃），14 d相对含量达到最高5.70%，42 d相对含量降至0.25%；随着发酵的进行，氧化芳樟醇、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯和2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯逐渐出现，其化合物的生成可能与发酵的堆温及微生物的代谢活动有关。甲氧基苯呈现陈味与甜味，对花香及愉悦香气具有掩蔽作用[22]，可作为紫娟（熟茶）发酵过程中的潜在气味标记物[23]。

醇类：紫娟晒青检测出芳樟醇（5.40%）、脱氢芳樟醇（3.51%）、法呢醇（0.17%）、柏木脑（1.10%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇（0.79%），发酵结束检测出芳樟醇（9.69%）、α-松油醇（0.71%）、法呢醇（0.37%）、柏木脑（0.93%），但从紫娟晒青（5.40%）至7 d （33.44%）、14 d（24.88%）至21 d（9.92%）时芳樟醇的相对含量达到整个发酵最大变化阶段。芳樟醇属于单萜化合物，具有诱发镇静和增强睡眠的生理作用[24]，研究[25-27]表明，可由原核微生物中的大肠杆菌、真核微生物中的酿酒酵母[21]、解酯耶氏酵母、毕赤酵母、恶臭假单胞菌等微生物所分泌的萜类合酶及修饰酶作用于前体物质生成，紫娟（熟茶）发酵7 d时芳樟醇相对含量增加，可能是发酵时所形成的微生物群落代谢的结果，对紫娟（熟茶）风味形成的作用仍需进一步研究。

酚醚类、酮类及酸类：β-萘甲醚、4-乙基苯甲醚、对苯二甲醚、2,4-二氨基苯甲醚、邻硝基苯十二烷醚只在紫娟（熟茶）发酵过程（7～35 d）检测出，酚醚类一般具有烟熏、刺鼻、异味等气息[21]，可能是造成紫娟（熟茶）发酵过程中刺鼻性气味、杂味的原因。酮类在发酵后期具有明显的变化，特别是β-胡萝卜素的降解产物[28]（α-紫罗兰酮、β-紫罗酮），其中，具有紫罗兰花的粉甜花香带木香底韵的α-紫罗兰酮和木香比α-紫罗兰酮浓郁并带果香香韵[21]的β-紫罗兰酮含量逐渐降低甚至消失，具木香、花香、果香的二氢-β-紫罗兰酮含量逐渐升高，挥发性成分种类的迭变可作为紫娟（熟茶）发酵进度判别的标准。

酸类：检出1 种。(Z,Z)-5,11-二十碳二烯酸从紫娟晒青（0.50%）、7 d（0.53%）、14 d（0.37%）、35 d（0.38%）至发酵结束（0.16%）呈现连续变化。

2.2.2 不同发酵阶段对香气形成的相互作用

为解析紫娟（熟茶）不同发酵阶段之间挥发性成分变化的相互关系及相互影响程度，对结果进行相关性分析，按照相关系数的大小主要将相关程度分为以下4 个情况：|r|≥0.8时，变量之间高度相关；0.5≤|r|＜0.8时，中度相关；0.3≤|r|＜0.5时，低度相关或弱相关；|r|＜0.3时，极弱相关或不相关[29-30]。表2表明：F0（0 d）和F1（7 d）之间相关系数为0.446 8，低度相关；F1（7 d）和F2（14 d）之间相关系数为0.920 36，高度相关；F2（14 d）和F3（21 d）之间相关系数为0.541 37，中度相关；F3（21 d）和F4（28 d）之间相关系数为0.978 34，高度相关；F4（28 d）和F5（35 d）之间相关系数为0.985 82，高度相关；F5（35 d）和F6（42 d）之间相关系数为0.245 53，小于0.3，极弱相关；7 个样品间的所有相关系数大于0，则7 个样品相互之间均为正相关。由此可知，发酵开始时紫娟晒青茶原料的质量对于生产过程中品质的改善及发酵结束后成品茶香气质量的提升具有重要作用，7 d（F1）至35 d（F5）的过程，是紫娟（熟茶）挥发性成分发生重要变化，奠定紫娟（熟茶）香气品质形成的关键时期。

表2 相关系数Table 2Correlation coefficients

2.3 紫娟（熟茶）发酵过程中香气特征分析

食品的风味根据来源不同，有植物的风味、肉类的风味[31]，风味浓度不同造成食品的营养性或毒性不同[32]，利用分析仪器与评价人员感官评价相结合方法成为感官科学研究的新方向[33]。感官审评结合GCMS、GC-嗅闻等技术探明普洱茶发酵过程中的香气变化规律，实现发酵茶的工业化生产监控并用于形成应用广泛、具有实际应用效果的茶叶风味轮，是保证普洱茶质量及实现茶产业科学化、安全化发展的前提。由表3可知，根据审评总得分，发酵过程中第3翻（F3）整体品质较好；香气方面，紫娟晒青（F0）呈现花香、果香、辛香，第1翻（F1）为果香、花果香，第2翻（F2）为熟果香、菌香有陈香，随着发酵的进行，陈香及酵香逐渐成为主要的香气特征，出堆时陈香减弱、香气呈现为木香带甜香、清凉感有辛香。紫娟（熟茶）人工发酵阶段具有较多不可控因素的影响，结合GC-MS技术探明发酵过程中香气变化规律，对实现发酵茶工业化监控具有重要意义。

表3 感官审评结果Table 3Sensory evaluation results

根据GC-MS分析结果，从7 个发酵阶段样中共检测出挥发性成分92 种，结合相关文献[21,34]，其中47 种具有明确的香气特征定性结果。结合定量分析，47 种明确香气特征定性成分从紫娟晒青、7、14、21、28、35 d和42 d相对含量分别为58.49%、70.53%、59.08%、36.14%、44.94%、42.98%、67.17%，发酵结束时具有明显香气特征的物质贡献率比紫娟晒青高8.68%，紫娟经过发酵过程可以丰富茶叶香气。

表4表明，(E,E)-2,4-壬二烯醛、p-伞花烃、芳樟醇、四氢-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮、脱氢芳樟醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇、β-环柠檬醛、异环柠檬醛、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮及法呢醇具有花香，累计相对含量为27.73%；脱氢芳樟醇、β-石竹烯及甜没药烯具有辛香，累计相对含量为8.69%；5,6,7-六氢-1,1,4a-三甲基-2(1H)-萘酮、2,2,6-三甲基环庚烷、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇、藏花醛、β-石竹烯、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、δ-杜松烯、柏木脑具有木香，累计相对含量为18.13%；(E)-β-罗勒烯、罗勒烯、脱氢芳樟醇、甜没药烯及法呢醇具有草本香，累计相对含量为7.20%；松油烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮及芳樟醇具有果香，累计相对含量为19.79%；萘、1-甲基萘及(－)-氧化石竹烯具有刺激性，累计相对含量为1.21%。由此可知，紫娟晒青的香气特征主要为花香、果香、辛香，此结果与感官审评结果一致。

表4 紫娟晒青（F0）香气特征Table 4Aroma characteristics of sun-dried Zijuan tea leaves

表5表明，紫娟人工发酵过程中挥发性成分香气特征类型增多：花香（玫瑰花、海桐花、紫丁花、紫罗兰花）、果香（熟果香、浆果香）、杏仁香、木香、奶香、脂香、甜香、辛香和清凉感，与紫娟晒青相比，花香型挥发性成分种类较紫娟晒青增加了顺式-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-甲醇、二氢-β-紫罗兰酮、α-松油醇、(+)-二氢香芹酮异构体混合物、2-十二酮、壬醛、反-5-癸烯醇、异水菖蒲酮及香树烯氧化物；果香、木香、辛香及刺激性的挥发性成分种类差异不大；并在发酵过程产生发酵独有的坚果香——苦杏仁香（苯甲醛）、动物香——奶香（对甲氧基苯乙烯）及微生物发酵气味。结合感官审评，紫娟（熟茶）的香气特征：花香（紫罗兰花、玫瑰花）、甜香、木香（温和木香）及微弱辛香。

表5 紫娟发酵过程（F1～F6）香气特征Table 5 Aroma characteristics of ripe Zijuan tea during fermentation

3 讨 论

经不同发酵阶段挥发性香气组分动态变化分析表明芳樟醇在整个发酵过程中变化明显，芳樟醇是香气比较复杂的化合物，兼有花香、果香和木香且香气柔和、轻扬透发[35]，脱氢芳樟醇含量过高，会掩盖芳樟醇的花香气息使其果香气息浓厚，紫娟晒青中脱氢芳樟醇相对含量为3.51%、芳樟醇相对含量为5.40%，此时芳樟醇的香气表现可能以淡弱的柑桔类果香韵调[21]为主；随着发酵的进行，脱氢芳樟醇在发酵7 d时消失，则后续发酵阶段，芳樟醇将会凸显花香特征，这可能是紫娟（熟茶）发酵过程香气逐渐丰富的原因之一。

紫娟经过发酵过程可以提升香气的丰富性，发酵过程中产生发酵独有的坚果香——苦杏仁香（苯甲醛）、动物香——奶香（对甲氧基苯乙烯）及微生物发酵气味。研究[21]表明，微生物发酵产生的典型香气化合物主要有萜烯类化合物、酯类及内酯类化合物、吡嗪化合物，如橙花醇、癸内酯、异戊酸异戊酯等，进一步明确紫娟（熟茶）发酵风味香与微生物之间的代谢关系，也成为亟待解决的问题，此问题的解决可为微生物定向发酵、精准控制发酵茶产品质量、发酵过程生物安全保障及发酵茶叶风味多元化开发提供理论基础和数据参考。

4 结 论

脱氢芳樟醇、β-石竹烯及甜没药烯是紫娟茶辛香特征的主要挥发性成分。紫娟晒青茶原料的质量对于生产过程中香气品质的改善及出堆后质量的提升具有重要作用，发酵7～35 d的过程，是紫娟（熟茶）挥发性成分发生重要变化，形成紫娟（熟茶）香气特征的关键期。紫娟（熟茶）人工发酵过程香气特征的变化：紫娟晒青（花香、果香、辛香）→发酵过程（花香、木香、辛辣感、微生物发酵香及杏仁香）→紫娟（熟茶）（花香（紫罗兰花、玫瑰花）、甜香、温和木香及微弱辛香），发酵而成的紫娟（熟茶）香气丰富性及甜香感增强。