高兆建，胡鑫强，宋玉林，丁飞鸿，赵宜峰，陈 腾,*

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018；2.长江桂柳食品睢宁有限公司，江苏 徐州 221000）

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一类水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键的淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖（麦芽三糖以α-1,6-糖苷键连接起来的聚合物）而得名[1]。普鲁兰酶解开复杂结构的支链淀粉，形成直链淀粉，提高淀粉利用效率从而降低淀粉加工能耗[2]，在淀粉相关的食品工业中应用广泛。当前，在葡萄糖、果糖、高浓度麦芽糖浆、抗性淀粉、啤酒生产中[3]，普鲁兰酶常与α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或环糊精葡萄糖基转移酶联合使用。普鲁兰酶除了在淀粉加工中的应用外，在饲料加工、废水处理[4]、药物化学和烘焙工业等多个领域也有巨大的应用价值。近年来，普鲁兰酶的研究受到持续关注。

根据酶底物特异性和水解产物种类，普鲁兰糖水解酶分为普鲁兰酶（I型和II型）或者支链淀粉水解酶（III型和IV型）[5]。其中I型普鲁兰酶（EC3.2.1.41）只对普鲁兰糖中的α-1,6-糖苷键具有专一性水解作用，并且麦芽三糖是其唯一的水解产物。研究表明，I型普鲁兰酶与淀粉酶协同作用，能完全、快速地水解淀粉多糖[6]，在淀粉糖化工艺中可以使用较高浓度的淀粉乳，减少糖化酶用量，缩短糖化时间，减少异麦芽糖副产物形成，从而最终减少淀粉生产高果糖浆甜味剂过程中葡萄糖的产生[5]。在食品营养方面，食用经I型普鲁兰酶制备的高抗性淀粉食品后，血糖和胰岛素水平都会降低，并且抗性淀粉通过在肠道中的发酵能达到防止便秘和增加短链脂肪酸含量的效果[7]。普鲁兰酶作为一种重要的辅助酶，在淀粉粒的水解中起着重要的作用。据报道，淀粉水解中添加普鲁兰酶可以降低糊精含量，提高葡萄糖产率，从而提高淀粉原料发酵制备乙醇的转化率[8]。现阶段，研究发现的普鲁兰酶主要适用于中温中性条件，在较高温度下稳定性较差。但普鲁兰酶的应用环境主要为高温和酸性，目前多数普鲁兰酶无法在这种环境中长时间保持高活性，因此研究耐高温I型普鲁兰酶对满足市场需求具有重要意义。

从前期分离筛选的解淀粉芽孢杆菌发酵培养液中分离纯化得到一种适合在酸性环境下使用的耐高温I型普鲁兰酶。本研究主要对该酶的分离纯化，分子质量，酶学特性包括酸碱稳定性、金属离子化学试剂作用效果、底物水解专一性等方面详细阐述，旨在为该酶的进一步开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

产普鲁兰酶菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21，分离自中国江苏徐州云龙区面粉加工厂附近土壤。

1.1.2 试剂

普鲁兰多糖、支链淀粉、直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精、麦芽三糖、麦芽四糖 美国Sigma公司；可溶性淀粉、糯米淀粉 徐州市大润发超市；Sephadex G-75、DEAE-Sepharose Fast Flow 美国Pharmacia公司；标准蛋白分子质量Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

液体种子培养基：糯米淀粉2 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，酵母提取物0.4 g/100 mL，KH2PO40.05 g/100 mL，NaCl 0.1 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.01 g/100 mL，pH 6.5，121 ℃灭菌15 min。

液体发酵产酶培养基：糯米淀粉2.0 g/100 mL，蛋白胨1.0 g/100 mL，酵母提取物0.5 g/100 mL，KH2PO40.05 g/100 mL，(NH4)2SO40.05 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.02 g/100 mL，pH 6.5，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；KTA Explorer 10型蛋白质纯化系统 美国GE公司；3K30型高速台式冷冻离心机 德国Sigma公司；SW-CJ-ZFD型双人单面超净工作台 苏州净化设备有限公司；Cascada LS型超纯水系统 美国Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢杆菌HxP-21普鲁兰酶（PulBa）的发酵制备

液体种子培养：将斜面生长的菌株接入50 mL液体种子培养基，摇床转速180 r/min，42 ℃培养18～24 h至对数生长期，以6%接种量接入发酵培养基振荡培养。

发酵产酶培养：培养温度45 ℃，装液量250 mL的三角瓶60 mL，发酵时间60 h。

1.3.2 酶活力的测定

参照Long Jie等[9]的方法并稍作修改。以普鲁兰糖为底物测定PulBa活性，2 g普鲁兰糖溶于100 mL乙酸钠缓冲液（20 mmol/L，pH 4.5），制备普鲁兰糖溶液。取200 μL酶液加入到200 μL的普鲁兰糖溶液中，50 ℃水浴30 min，添加400 μL二硝基水杨酸试剂，并在水中煮沸5 min，冰水浴中迅速冷却。加去离子水使最终反应体积4 mL。紫外分光光度计记录540 nm波长处的吸光度。1 个单位的普鲁兰酶活力定义为在50 ℃条件下1 min内水解底物产生1 μmol还原糖的量。

1.3.3 PulBa的分离纯化

1.3.3.1 硫酸铵分级沉淀

发酵结束后的培养液10 000 r/min、4 ℃离心15 min，菌体与发酵液分离，保留的上清液即为粗酶液。向粗酶液中逐渐加入固体硫酸铵达到40%饱和度，4 ℃搅拌过夜，按上述离心后取上清液按照90%的饱和度添加硫酸铵，过夜盐析后，10 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集蛋白质沉淀，并将其重悬于适量的20 mmol/L、pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液中，并充分透析。

1.3.3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

将完全透析后的粗酶液上样于pH 6.0、20 mmol/L磷酸缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱中，相同缓冲液洗柱至吸收线平行，再以含0～0.9 mol/L NaCl的同一缓冲液洗脱，流速0.8 mL/min，每管收集2 mL，平板打孔法测定洗脱峰酶活力并合并PulBa活性组分。

1.3.3.3 Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析

以20 mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液充分平衡层析柱（80 cm×1.5 cm），2 mL经离子交换层析收集并浓缩的有效活性组分上样，相同缓冲液洗脱，流速1 mL/min，收集各洗脱蛋白峰，平板水解圈法测定酶活力，确定有效层析峰。

1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）与酶谱分析

使用SDS-PAGE测定纯化效果及PulBa分子质量，10%分离胶，5%浓缩胶。低分子质量标准蛋白作为参照。考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量。PulBa的酶谱测定参照Lu Zhenghui等[10]的方法并稍微改动，10 g/100 mL的分离胶中加入0.5 g/100 mL的普鲁兰糖，电泳结束后，凝胶去离子水浸泡洗涤后浸泡于50 mmol/L的乙酸钠缓冲溶液（pH 4.5），50 ℃孵育2 h，再覆盖卢革氏碘液，显色条带与考马斯亮蓝染色条带对照。

1.3.5 酶学性质分析

1.3.5.1 酶的最适反应温度及热稳定性

将酶液适当稀释后与等量50 mmol/L的乙酸钠缓冲溶液（pH 4.5）混合，在30～90 ℃测定酶活力，确定最适反应温度。将等量酶液分别于40～80 ℃条件下孵育2 h，每隔0.5 h测定一次酶活力，以最高酶活力为100%，测定不同温度下酶稳定性。

1.3.5.2 酶的最适pH值及稳定性

使用pH 3.0～8.0的缓冲液（pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液、pH 3.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液、pH 6.0～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液）与适当稀释后的等量酶液混合，50 ℃反应测定酶活力，确定最适反应pH值。将等量酶液于pH 3.0～8.0、4 ℃条件下，孵育6 h，测定酶活力，检验此种酶的pH值稳定性。

1.3.5.3 金属离子及化学试剂对酶活力的影响

将不同无机盐溶液（NaCl、NaNO3、KCl、LiCl、ZnCl2、Cu Cl2、NiCl2、MgCl2、CaCl2、BaCl2、MnCl2、FeCl2、CoCl2、PbCl2，浓度为5 mmol/L）与等量PulBa溶液混合，按1.3.2节方法测定酶活力，设不加金属离子组为对照组，测定金属离子对PulBa活力的影响。

不同化学试剂乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、尿素、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巯基乙醇、二硫代苏糖醇（dithiothreitol，DTT）与PulBa等量混合，按1.3.2节方法测定酶活力，设不加化学试剂组为对照组，测定不同化学试剂对PulBa活力的影响。

1.3.5.4 酶的反应底物特异性与动力学参数的测定

以普鲁兰糖、马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉、α-环糊精、β-环糊精、直链淀粉为底物，按照1.3.2节方法测定酶活力。动力学参数测定参照前期研究[11]的方法并有所改动。分别以普鲁兰糖、马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉为底物（0.2～1.2 mg/mL），20 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 4.5）体系，50 ℃测定不同底物浓度时的反应速度。用Lineweaver-Burk法作图，得到动力学曲线，绘制双倒数曲线，求出酶的Km、Vmax。

1.3.5.5 普鲁兰糖水解产物薄层层析

以20 mmol/L的乙酸钠缓冲溶液（pH 4.5）配制0.5 g/100 mL的普鲁兰糖溶液，以麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽二糖和葡萄糖构成的混合糖液作为标准样，将2 mL分离产物与2 mL的普鲁兰糖溶液混合，在50 ℃下反应6 h，将反应产物上样到硅胶板上，以正丁醇、乙醇和水（5∶3∶2，V/V）混合溶液为展开剂，展开后以含10%浓硫酸的乙醇溶液喷洒层析板，再在120 ℃烘箱烘中烘烤至显色。

1.4 数据统计和分析

2 结果与分析

2.1 PulBa分离纯化

2.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

经硫酸铵分级盐析、透析后的粗酶液进一步离子交换层析，洗脱曲线如图1所示，得到5 个洗脱峰，其中3号洗脱峰较大，平板水解圈法定性检测显示3号洗脱峰有酶活力，1、2、4、5号峰为杂蛋白。PulBa活性主要出现在18～24管，对应NaCl洗脱浓度0.15～0.40 mol/L。合并有活性的收集管分析检测，总蛋白为17.2 mg，总活力为760.2 U，比活力为44.2 U/mg，纯化倍数5.2 倍。

图1 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析Fig.1 Elution profile of PulBa byDEAE-Sepharose Fast Flow ionexchange chromatography

2.1.2 Sephadex G-75凝胶过滤层析

洗脱曲线如图2所示，柱层析得到3 个大洗脱峰和1 个小峰。活性检测平板显示3号峰（100～120 min）有酶活力，其他为杂蛋白峰。各纯化步骤情况如表1所示，最终获得的纯化PulBa酶液总蛋白3.5 mg，总活力为617.7 U，比活力为176.5 U/mg，纯化倍数达到20.8 倍，回收率53.2%。纯化效果显著，比活力明显提高，说明分离纯化的介质和方法正确、高效。目前文献报导了不同的纯化方法，Lu Zhenghui等[10]利用镍柱分离获得重组大肠杆菌表达的普鲁兰酶，回收率为52.8%，比活力270 U/mg；Wei Wei等[12]纯化的I型普鲁兰酶比活力44.7 U/mg；Aty等[13]等从Bacillus subtilisMF467279纯化的普鲁兰酶比活力19.7 U/mg；Li Xiaoxiao等[14]从B.subtilisstr.168中分离纯化的普鲁兰酶比活力136.06 U/mg。本研究建立的分离纯化PulBa的方法，比大多报道的比活力高，并且在酶的回收率、纯化倍数方面也具有优势，可为不同普鲁兰酶的分离纯化提供参考。

图2 Sephadex G-75凝胶过滤层析Fig.2 Elution profile of PulBa by Sephadex G-75 gel filtration chromatography

表1 解淀粉芽孢杆菌HxP-21 PulBa的分离纯化Table 1Summary of the purification procedure of PulBafrom B.amyloliquefaciens HxP-21

2.1.3 SDS-PAGE分析

经柱层析后的活性样品进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。经离子交换层析去除大量杂蛋白及色素，但SDS-PAGE仍显示含有较多杂蛋白。经两次柱层析后的样品泳道2显示单一条带，表明纯化后组分基本达到电泳纯水平，与标准蛋白对照其分子质量约为51.2 kDa。还原与非还原SDS-PAGE分析发现，PulBa在还原与非还原条件下均为同样分子质量大小的单一条带，表明酶中不存在二硫键，初步推测PulBa单亚基蛋白。非还原SDS-PAGE后凝胶经孵育酶解，卢革氏碘液染色显示单一活性条带（图3泳道3），位置与考马斯亮蓝染色条带一致，说明经两次柱层析纯化的样品泳道2单一条带为PulBa酶蛋白。其分子质量与报道的其他普鲁兰酶相比偏小，如Song Wan等[15]报道的B.naganoensisJNB-1基因重组表达的酶分子质量为100 kDa，Wang Yue等[16]报道的重组芽孢杆菌产物分子质量为101 kDa，Zeng Yan等[17]报道的14 种不同基因来源的重组菌株的产物的分子质量都处在100～121 kDa之间，Li Xiaoxiao等[14]报道的枯草芽孢杆菌STR的PulA基因重组酶分子质量83 kDa。但与Wu Huaiwei等[18]报道的源于Thermus thermophilusHB27基因重组表达的普鲁兰酶分子质量（52 kDa）非常接近，而比吴永等[19]报道的巨大芽孢杆菌P6普鲁兰酶（分子质量为43 kDa）大。

图3 PulBa纯化步骤SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analyses of PulBa at different purification steps

2.2 酶学性质分析

2.2.1 酶的最适温度及热稳定性

如图4所示，在30～90 ℃范围内酶活力差异显著，酶最适作用温度55 ℃，但45～70 ℃之间酶活力都在55 U/mL以上，说明PulBa适合高温反应，即使温度达到80 ℃时，仍具有高于40 U/mL的活力。不同来源的普鲁兰酶最适作用温度差异较大，Wei Wei等[12]报道的重组普鲁兰酶40 ℃；孙利鹏等[20]研究的耐热普鲁兰酶75 ℃，但超过80 ℃后酶活力立刻下降，85 ℃时酶活力不足50%；Zareian等[21]研究的普鲁兰酶65 ℃，80 ℃时酶活力下降至约40%；王凤寰等[22]报道的普鲁兰酶与PulBa相似，其最适温度为55 ℃，但在高于60 ℃后，酶活力迅速下降，65 ℃时只有8.75%的酶活力。与文献相比，显著差异在于PulBa在较广的温度范围内（45～70 ℃）保持高活力，而文献报道的往往温度稍微波动，酶活力则迅速下降[23]。实际应用中，PulBa对酶解工艺要求不必过于苛刻，在宽泛的温度范围内都可达到好的酶解效果。如图5所示，酶热稳定性较好，40～70 ℃随着时间延长，酶活力下降缓慢，保温120 min后40、50、60 ℃和70 ℃对应相对酶活力仍保持100%、96%、91%和83%。80 ℃保温60 min还保持75%。国内外文献报道了不同来源酶的热稳定性情况，Wu Huawei等[18]研究的热稳定普鲁兰酶70 ℃处理60 min后，保留了约70%的活性；Long Jie等[9]报道的非固定化的普鲁兰酶60 ℃保温120 min残余酶活力低于70%；Lu Zhenghui等[10]报道的B.pseudofirmus703普鲁兰酶45 ℃以下稳定，50 ℃时则迅速失活；Wei Wei等[12]研究的B.cereusNws-bc5 I型普鲁兰酶50 ℃保温60 min残余酶活力仅有约40%。PulBa有较好的热稳定性优势。

图4 PulBa的最适反应温度Fig.4 Optimal reaction temperature of PulBa

图5 温度对PulBa稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the stability of PulBa

2.2.2 酶的最适反应pH值及pH值稳定性

如图6所示，最高酶活力出现在pH 4.5，在pH 3～6表现出较高酶活性，均高于60 U/mL。但pH值高于6.0时，随pH值升高酶活力急剧下降。pH 8.0时的酶活力仅为20 U/mL，说明PulBa更适合酸性环境。与PulBa相似的还有Roy等[24]报道的II型普鲁兰酶最适pH值为5.0，在pH 4.5～5.6时有较高活性；Kahar等[25]报道的嗜热芽孢杆菌普鲁兰酶最适pH 6.0；Odibo等[26]报道的嗜热放线菌普鲁兰酶最佳反应pH 5.0；Zhang Huanxin等[27]报道的最适反应pH 5.0。目前报道的大多数普鲁兰酶的最适pH值集中在5.0～9.0[10,12,18,28-29]内。由图6 pH值稳定性曲线可以看出，在pH 3.0～7.0的范围中，处理6 h后酶活力都维持60 U/mL以上，说明在这些pH值条件下长时间处理对酶活力产生的影响极小，适合于长时间的使用。而在pH 7.0～8.0残余酶活力下降明显，但依旧能达到45 U/mL。Liu Jingjing等[30]报道的Paenibacillus barengoltzii基因异源表达的普鲁兰酶，不同pH值条件下30 min后酶活力在80%左右。Xu Qingrui等[31]所报道的来自Paenibacillussp.SSG-1的普鲁兰酶在pH 6～7范围酶活力较稳定，但超出以上范围酶活力损失严重。

图6 PulBa的最适pH值及其pH值稳定性Fig.6 Optimal reaction pH and pH stability of PulBa

2.2.3 不同金属离子和化学试剂对酶活力的影响

表2 金属离子和化学试剂对PulBa活性的影响Table 2Effect of various metal ions and chemical reagents on PulBa activity

如表1所示，为确定酸根离子Cl－是否对酶活力产生影响，以NaNO3作对照，结果显示NaCl和NaNO3对酶活力均有较弱的激活作用，两者无明显区别，表明酸根离子Cl－和NO3－对酶活力没有影响。在金属离子中，Na+和K+对酶略有激活作用；激活作用最为显著的是Mg2+和Ca2+，在低浓度1 mmol/L和高浓度10 mmol/L时激活作用均偏弱，当浓度5 mmol/L时，相对酶活力分别提高至127.6%和131.9%。很多普鲁兰酶活力需要Ca2+激活并维持结构稳定性[32]。Shewanella arctica来源的I型普鲁兰酶Pul13A[33]、B.cereusNws-bc5来源的普鲁兰酶PulBC[26]都是Ca2+依赖型的普鲁兰酶。据报道Klebsiella pnumoniae普鲁兰酶的晶体结构中发现了5 个钙结合位点[34]，认为Ca2+通过与这些结构与的界面附近的水分子或氨基酸残基相互作用而协调八面体的几何形状，因此可能有助于提高酶的热稳定性；Li+、Ba2+和Cu2+对酶活力没有显著作用，而Wu Huawei等[18]报道的Thermus thermophilusHB27耐热型普鲁兰酶则被Cu2+完全抑制；Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe2+和Co2+对酶活力产生较强的抑制作用，这与Wei Wei等[12]报道的I型普鲁兰酶受到Ni2+、Mn2+抑制相似；其中Pb2+和Hg2+有最强的抑制作用，酶活力完全丧失，可能因为其与PulBa半胱氨酸残基上的巯基反应从而破坏酶的三级结构，使其完全失去酶活力。所有测试的化学试剂都对酶活力产生抑制作用，其中EDTA、β-巯基乙醇和DTT的抑制作用非常强烈，残余酶活力仅不到40%；SDS和Tween 80抑制作用较弱，残余酶活力都在85%以上，但Elleuche报道[33]的普鲁兰酶在0.35 mol/L SDS存在时能显著激活酶活力达139%；尿素和CTAB抑制作用中等，处理后残余酶活力分别在62.3%和73.5%，阳离子试剂CTAB可能结合在酶的催化活性中心带负电荷的氨基酸残基[33]；EDTA抑制PulBa活性，可能是EDTA作为金属螯合剂，结合走了PulBa结构中所需要的金属离子导致PulBa活力的降低，进一步说明PulBa是Mg2+或Ca2+依赖型金属酶；DTT和β-巯基乙醇都能够严重抑制PulBa活力，说明在酶的结构中存在着大量的二硫键用于构建蛋白质的二级结构，这两种修饰剂能够破坏已经形成的二硫键，从而导致了蛋白质酶活力的降低，但Elleuche等[33]报道的Shewanella arcticaI型普鲁兰酶DTT反而可使酶活力提高至150%。以上特性同报道的普鲁兰酶对比发现有些酶特性相类似，而很多金属离子和化学试剂对酶的作用效果有较大差异，说明PulBa存在结构上的特异性，导致出现各种金属离子和化学试剂存在时，酶活力存在显著的差别现象。

2.2.4 底物特异性分析

如表3所示，底物为普鲁兰糖时，PulBa有最高活力，米氏常数Km为1.34 mg/mL，最大反应速率Vmax为24.6 μmol/（min·mg）；以马铃薯支链淀粉和玉米支链淀粉为底物，相对酶活力约在40%，对应Km分别为6.54、6.10 mg/mL，Vmax分别为9.5、10.7 μmol/（min·mg）；当底物为可溶性淀粉或糖原时，酶活力相近，约20%，对应Km分别为7.9、8.3 mg/mL，Vmax分别为5.1、4.5 μmol/（min·mg）。α-环糊精、β-环糊精和直链淀粉则完全没有酶活力。说明PulBa专一性水解α-1,6-糖苷键，而对α-1,4-糖苷键无水解活性，属于I型普鲁兰酶。通常，I型普鲁兰酶对分子结构中存在α-1,6-糖苷键的多糖如普鲁兰糖、支链淀粉、糖原等有广泛的底物特异性[30]，而PulBa对普鲁兰糖表现出严格的底物特异性，对支链淀粉活性、糖原活性很弱，对其他底物无水解活性。推测PulBa是一种新型的普鲁兰酶，其结构和报道的存在差异。PulBa以普鲁兰糖为底物Km与Lu Zhenghui[10]、Wei Wei[12]等报道的I型普鲁兰酶一致；但比Talekar[35]（Km3.54 mg/mL）、Singh[36]等（Km4.4 mg/mL）报道的相比偏小，说明PulBa对普鲁兰糖有更强的亲和性；但相比于来源于B.subtilis（Km0.032 mg/mL）[37]、B.pseudofirmus703（Km0.31 mg/mL）[10]、B.cereusNws-bc5（Km0.45 mg/mL）[12]等菌株的Km值较大。

表3 普鲁兰酶底物特异性分析Table 3Substrate specificity of the purified PulBa

为了确定PulBa对底物普鲁兰糖的水解产物情况，通过薄层层析分析水解产物。由图7看出，泳道2酶液与普鲁兰糖溶液反应后的产物为单一的麦芽三糖，无葡萄糖、麦芽糖和麦芽四糖存在。与泳道3对比发现，若有未被水解的普鲁兰糖则会留在点样处，泳道2上样处无底物显示，说明泳道2中上样普鲁兰糖被完全水解。因普鲁兰糖完全由α-1,4-糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6-糖苷键聚合而成的直链状多糖，PulBa能专一性水解α-1,6-糖苷键，而对α-1,4-糖苷键无水解活性，所以PulBa对底物经过充分水解后得到唯一产物为麦芽三糖。PulBa对α-1,6-糖苷键的专一水解特性使其在应用方面具有诸多优势，在淀粉水解方面可与糖化酶一起使用，彻底水解淀粉支链，提高淀粉的糖化效率由液化淀粉浆来生产高葡萄糖浆和高麦芽糖浆。还可水解液化淀粉中的α-1,6-D-糖苷键而产生包含α-1,4-D-葡萄糖键的直链多聚糖。

图7 普鲁兰糖水解产物的薄层层析Fig.7 TLC analysis of the hydrolysate of pullulan by the purified PulBa

3 结 论

本研究以前期分离筛选的解淀粉芽孢杆菌HxP-21为菌种，发酵后，通过一系列的分离纯化步骤获得了电泳纯的PulBa。经纯化比活力达到176.5 U/mg，回收率53.2%，纯化倍数20.8，整体纯化效率高。PulBa分子质量与文献报道的有较大区别。PulBa在酸性条件及较高温度下催化活力强，55 ℃、pH 4.5催化活力最高。在较高的温度范围及宽泛的酸性条件下PulBa表现出较强的稳定性。不同的金属离子、化学试剂对PulBa的激活或抑制作用与报道的普鲁兰酶相比，某些作用效果有相似性，但在很多方面存在显著差异。底物特异性研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶，但在底物专一性方面又和多数报道的I型普鲁兰酶不完全相同。总的来说，PulBa在分子质量、酸碱稳定性、最适酶解条件、理化性质及底物专一性方面表现出独特的性质。尤其在热稳定性方面PulBa优势更为突出（80 ℃保温60 min酶活力还保持75%），是典型的热稳定性普鲁兰酶。PulBa有望应用于一些特定高温酸性环境的淀粉加工中或者微生物发酵、生物能源、垃圾降解等具有特殊生产环境的领域。