刘静波，王子秦，于一丁，张 婷，刘博群*

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林省营养与功能重点实验室，吉林 长春 130062）

本研究以豆粕为原料，通过超声辅助酶解制备ACE抑制活性肽，并进行分离纯化、结构鉴定，采用分子对接技术阐述ACE抑制活性肽的作用机理，旨在为豆粕原料深加工和高效利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂大豆粕 中国长春市华程生物技术有限公司；复合风味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g） 诺维信公司；马尿酸马尿酰-组胺酰-亮氨酸、A6778 ACE（来自兔肺，3.7 U/mg蛋白质（Warbur-Christian改性），批号SLBZ2889） 美国Sigma公司；氢氧化钠 北京化工厂；乙腈、甲酸、三氟乙酸（均为色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；合成肽 生工生物工程（上海）股份有限公司；P0017考马斯亮蓝快速染色液 上海碧云天生物技术公司；PR1300超低分子质量蛋白质Marker（3.3～20.1 kDa）、P1320 Tris-Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒 北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JY92-2D超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；XX8200230小型切向流超滤系统美国密理博公司；蛋白纯化系统 瑞典ÄKTA公司；FD-1A-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；Orbitrap Elite高场静电场轨道离子阱质谱仪 美国Thermo Fisher公司；LC-2010超高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；Z800计算工作站 美国惠普公司；FD-1A-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；Chemi Doc凝胶成像仪 美国伯乐公司；TY-80B脱色摇床常州市国立实验设备研究所。

1.3 方法

1.3.1 豆粕肽的制备

将豆粕粉碎后过60 目筛，按底物质量浓度4 g/100 mL制备豆粕水溶液，并调至复合风味蛋白酶的最适pH值为6.5，磁力搅拌15 min。随后进行超声波预处理（150 W，12 min），再置于酶的最适温度50 ℃恒温水浴锅中，酶与底物质量之比为1∶100，酶解7 h后，进行灭酶操作（90 ℃，10 min），将酶解液冷却至室温后，进行离心处理（4 ℃、4 000 r/min离心10 min），收集上清液进行下一步分离纯化。

1.3.2 豆粕肽的分离纯化及分子质量分布鉴定

所以，不能简单地认为模式创新降低了某方面成本，就意味着整体成本的降低。在今天看来，成本这本账不是一个简单的加减法。

将酶解上清液用Tris-Tricine-SDS-PAGE方法对其分子质量分布进行鉴定，随后用截留分子质量为0.2、1、3、10 kDa和30 kDa的超滤膜进行分离，收集5 种豆粕肽组分（0.2～1、1～3、3～10、10～30、＞30 kDa），对比各自体外ACE抑制活性值，并选取最优的活性组分（0.2～1 kDa）经过ÄKTA蛋白质纯化系统（层析介质SephadexG15、上样量4 mL、洗脱流速1.0 mL/min）进一步分离纯化，将分离得到的5 个不同峰（F1、F2、F3、F4、F5）组分进行收集，经真空冷冻干燥后，－20 ℃贮存，以备进行体外ACE抑制活性指标测定。

1.3.3 豆粕肽体外ACE抑制活性的测定

采用实验室已建立的高效液相色谱法[24]。

1.3.4 ACE抑制肽序列鉴定

利用液相色谱-串联质谱对ACE抑制活性最高的纯化组分F2峰进行鉴定。通过Orbitrap Elite质谱仪的EASY-nLC 1000系统分析样品，色谱条件：色谱柱填料为C18，预柱（长度2 cm、内径100 μm），分析柱（长度15 cm、内径75 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸溶液（V/V），B相为0.1%甲酸-乙腈溶液（V/V）；梯度洗脱：0～2 min，98%A，2% B；2～77 min，98%～65% A，2%～35% B；77～81 min，65%～25% A，35%～75% B；81～91 min，25% A，75% B；进样量2 μL；流速300 nL/min。

质谱条件：离子化方式：电子电离源；电压：2 200 V；质量扫描范围m/z350～1 600，选取一级谱后3 s内信号最好的峰做二级碎裂，碎裂模式为高能诱导裂解技术（higher energy collision induced dissociation，HCD）。在数据依赖模式下运行，在傅里叶变换模式下进行全质谱扫描，分辨率为60 000。自动增益控制目标为4×105一级离子轨道扫描和5×104二级质谱扫描。动态排除采用以下参数：隔离窗口m/z2；重复计数1；重复持续时间25 s；排除时间为60 s。所得结果经过与蛋白质数据库（UniProt）比对，得到氨基酸序列。

1.3.5 ACE抑制活性肽的合成

采用9-芴基甲氧基羰基保护基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）固相合成方法合成寡肽（纯度98%），由上海生工生物工程股份有限公司协助完成。

1.3.6 分子对接[25]及ACE抑制肽活性机制解析

先利用AutoDock Tools 1.5.4软件对活性肽配体和ACE受体进行对接前的准备，再通过软件AutoDock 4.2进行活性肽与ACE晶体结构展开半柔性分子对接计算[26]，最后对分子对接的结果进行可视化处理，具体操作如下：

从RCSB蛋白质数据库（http://www.rcsb.org/）获得ACE晶体结构（PDB ID：1O86）。大分子受体的准备：去除1O86周围的水分子以及小分子配体（GLY2000、LPR702），保留Zn2+、Cl－和ACE蛋白，再加力场，获得pdb格式文件；加极性氢并添加原子类型后保存为pdbqt格式文件。小分子肽配体的准备：运用CHARMM力场对小分子肽进行能量最小化处理获得pdb格式文件；判定肽的root后选择配体的可旋转键，保存为pdbqt格式文件并手动更改可旋转键数。格点（Grid）文件的准备：为了提高ACE与活性肽对接的准确度，采用Zn2+的空间坐标为中心（中心坐标为x=43.821，y=38.240，z=46.712）建立一个间距为0.375 Å，大小为100 Å×100 Å×100 Å的反应约束盒子[27]。将准备好的受体“1O86”的pdbqt格式文件和配体“肽”的pdbqt格式文件进行分子对接：运用拉马克遗传算法对分子对接能量进行优化并进行200 次对接模拟，最终保存为“1O86-肽”dpf格式文件。分别通过Discovery Studio可视化版本、PyMOL蛋白可视化软件对ACE抑制肽与ACE蛋白分子间相互作用（静电力、氢键、亲水/疏水作用力等）进行分析和展示[28]，同时确定肽周围3.5 Å的ACE上的氨基酸残基，从而对ACE抑制肽活性机制进行解析。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 豆粕肽分子质量和分离纯化后不同组分体外ACE抑制活性分析

首先对制备出豆粕肽的分子质量进行鉴定，Tris-Tricine-SDS-PAGE结果如图1A所示，豆粕肽的分子质量主要集中在6 000 Da以下分布。对其超滤分离后，得到了5 组不同分子质量的豆粕肽进行ACE抑制活性测定，低分子质量（200～1 000 Da）的抑制活性较高，达到了217.33 μg/mL（图1B）。这一现象与Pihlanto等[29]研究结果相符合，一方面可能是因为分子质量在1 000 Da以下的超滤组分可能包含了酶解液中多数的ACE抑制活性肽，另一方面可能是因为ACE与肽结合位点是在ACE的活性中心，且存在疏水孔道，分子质量太大的肽无法进入此通道，导致分子质量较小的肽可能具有更高的ACE抑制活性。对低分子质量（200～1 000 Da）的豆粕肽进一步经过色谱纯化，得到了峰图（图1C）并经体外ACE抑制活性实验得到F2峰的ACE抑制活性较高，其IC50可低至（97±0.5）μg/mL（图1D）。故本研究将低分子质量（200～1 000 Da）肽中的F2组分进行肽序列鉴定。

图1 豆粕肽分子质量及ACE抑制活性分析Fig.1 The analysis for molecular mass of peptides from soybean meal and ACE-inhibiting activity

2.2 ACE抑制肽序列鉴定结果

将200～1 000 Da的豆粕肽酶解液组分经ÄKTA继续纯化得到的F2组分冻干样品通过液相色谱-串联质谱进行鉴定，所得二级质谱结合软件分析及蛋白质数据库，鉴定并选取三肽22 条（GCP、GDP、GGP、GGW、GHP、GMP、GRP、GTY、GVW、GYW、IEW、ILP、IQP、LEP、LLY、VHP、VPP、VPW、VRP、VSP、VTP、VWW）；四肽序列25 条（GCPP、GGCP、GGGW、GHDP、GKSP、GLVP、GNLP、GPVY、GTYW、GVRP、GWCP、IVTP、LALP、LASP、LCGY、LGRP、LKIW、LDDY、LILP、LNKY、LVPP、VPWP、VQVP、VVTP、VYVW）；五肽序列34 条（GDDFW、GEQMP、GGCPP、GGPVY、GGVRP、GGWCP、GHDPY、GLDDY、GLVPP、GSCLY、GWCTW、IDDGW、IIVTP、IQFAP、IQPDW、ISGGP、LAKAY、LCGYW、LEENY、LFEDP、LKVHP、LSEEY、LTEVP、LTVSP、VEQVY、VFAVY、VGHDP、VGLVP、VHCAY、VKFDY、VPGMP、VQVPW、VSLEP、VTPSP），再以最低预测自由能为评价指标，通过AutoDock进行虚拟筛选，共得到2 个最低预测结合能较优的多肽序列，四肽GVRP和五肽IIVTP的最低预测自由能分别为－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。一般来说，对接最低预测结合能值越低，表示ACE-肽结合越紧密，ACE-肽复合物越稳定。

图2C表明GVRP通过HCD碰撞断裂所产生的bn与yn离子系列，其中b2离子157.12、b3离子313.23分别与m/z157.10、313.20相匹配，y1离子116.10、y2离子272.14、y3离子371.19以及y4离子427.23分别与m/z116.07、272.17、371.24以及427.25相匹配，其中有误差的均为部分减水、减氢导致，并已经标注。

图2 GVRP（A）、IIVTP（B）的结构式及GVRP（C）、IIVTP（D）的二级质谱图Fig.2 Structural formulae of GVRP (A) and IIVTP (B), and secondary MS of GVRP (C) and IIVTP (D)

同理，对IIVTP（Ile-Ile-Val-Thr-Pro）进行同样的数据分析和讨论，其结构式如图2B所示，二级质谱图（图2D）结果表明IIVTP通过HCD碰撞断裂所产生的bn与yn离子系列，其中b2离子227.15、b3离子326.20和b3离子427.29分别与m/z227.18、326.24、427.29相匹配，y1离子116.10、y2离子217.12、y3离子316.18、y4离子429.15以及y5离子541.34分别与m/z116.07、217.12、316.19、429.27及541.35相匹配，其中有误差的均为部分减水、减氢、减氨基的原因所致，并已经标注。

2.3 ACE抑制肽的合成与活性测定

对四肽GVRP和五肽IIVTP采用FMOC固相合成方法合成，并利用高效液相色谱法测定其体外ACE抑制活性，IC50值分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L，IC50值越小活性越大。经过对GVRP、IIVTP的IC50与酶解液的IC50统一单位（μg/mL）进行比较，计算可得其IC50分别为：GVRP（35.91 μg/mL）、IIVTP（41.71 μg/mL），由此可得合成的纯肽GVRP、IIVTP的ACE抑制活性明显好于200～1 000 Da中F2峰酶解液的ACE抑制活性（（97±0.5）μg/mL）。GVRP的分子质量是427.5 Da，等电点为pH 11.05；IIVTP的分子质量是541.69 Da，等电点为pH 5.52。这与Iwaniak等[30]的研究结果一致：体外ACE抑制活性的肽序列常常表现出以下2 种特征：N端为疏水性氨基酸，尤其是包含有脂链的氨基酸Gly、Ile、Leu、Val；C端包含有芳香环的氨基酸Pro、Tyr、Trp。

2.4 分子对接与豆粕ACE抑制肽的抑制机理解析

研究表明，ACE抑制肽的氨基酸构成与它的抑制活性有着紧密的关系，所以，四肽和五肽的氨基酸残基和ACE相互作用关系的探讨有助于对ACE抑制活性机理进一步解析[31-32]。通过AutoDock程序研究了GVRP、IIVTP对ACE的抑制机制，从分子角度阐述优选出的ACE抑制活性肽与ACE结合的具体关系。

配体与ACE残基的过近接触示意图如图3所示。过近接触是指至少有一个原子存在于配体周围3.5 Å范围内。由表1可知，四肽GVRP与ACE的氨基酸残基Glu403（OE2：2.0 Å；OE1：2.0 Å）、Glu384（OE2：2.0 Å）、Tyr523（OH：2.1 Å）之间形成了4 个氢键，其中GVRP和氨基酸残基Glu403之间含有2 个氢键盐桥；与Glu384之间含有1 个氢键盐桥；与Tyr523之间形成的传统氢键且氢键的键长最长，结合最不紧密。五肽IIVTP与ACE的氨基酸残基Lys511（HZ3：2.8 Å）、Gln281（HE22：1.7 Å）、His353（HE2：2.0 Å；HE1：2.1 Å）、His513（HE2：3.0 Å；HE1：1.7 Å）、Glu162（OE2：1.8 Å）、Asp377（OD1：2.6 Å）之间形成了8 个氢键，其中GVRP和氨基酸残基Lys511之间含有1 个氢键盐桥；与Gln281、Glu162之间各含有1 个传统氢键；与His353、His513之间分别形成1 个传统氢键和1 个碳氢键；与Asp377之间形成1 个碳氢键。其中与Gln281的传统氢键键长和与His513的碳氢键键长较其他氢键相比最短，结合最为紧密。

图3 GRVP（A）与IIVTP（B）结合ACE活性中心Fig.3 Active binding sites of ACE for GVRP (A) and IIVTP (B)

表1 GVRP与ACE间氢键作用、IIVTP与ACE间氢键作用Table 1Hydrogen bonding between GVRP and ACE, and between IIVTP and ACE

与此同时，找到GVRP、IIVTP配体周围过近接触在3.5 Å范围内的ACE氨基酸残基（表2），因为这些残基对配体和受体的结合起到至关重要的作用，比如疏水作用力和静电力，通过比对发现GVRP和IIVTP配体周围共有的过近接触ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384，极大程度上丰富了ACE可能活性位置的研究。

表2 GVRP与ACE间存在过近接触的ACE残基、IIVTP与ACE间存在过近接触的ACE残基Table 2Residues of ACE closely contacting with GVRP and those closely contacting with IIVTP

樊玥[33]通过分子对接结果得出ACE含有活性口袋S1、S1’、S2，口袋S1中包含氨基酸残基Ala354、Glu384、Tyr523，口袋S1’包含氨基酸残基Glu162，口袋S2包含氨基酸残基Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520。管骁等[34]指出常见的ACE活性口袋包含以下氨基酸残基：His353、Ala354、Ser355、Ala356、Val380、His383、Glu384、His387、Glu411、Lys511、Phe512、His513、Val518、Tyr520、Arg522、Tyr523。经过比对发现GVRP可以与ACE的S1活性口袋中的2 个氨基酸残基Glu384、Tyr523进行结合；IIVTP可以分别与ACE的S1’活性口袋氨基酸残基Glu162，以及ACE的S2活性口袋氨基酸残基Lys511、Gln281、His513、His353进行结合。

对比GVRP和IIVTP与ACE结合产生的氢键个数可以发现，GVRP的氢键个数为4 个，IIVTP的氢键个数为8 个，研究表明短肽与ACE形成越多的氢键，具有越强的相互作用[35]，与ACE抑制活性GVRP的IC50值（84±0.06）μmol/L，IIVTP的IC50值（77±0.08）μmol/L相吻合，即IIVTP的活性优于GVRP的活性。由此可知，肽和越多的ACE活性口袋结合时，其抑制活性显著增强；且短肽与ACE形成越多越强的氢键，就能够显著增强ACE和短肽的分子间相互作用，同时可以提高肽的ACE抑制活性。

3 结 论

目前，豆粕肽的研究主要集中在优化制备阶段，进一步分离提纯、鉴定活性肽氨基酸序列，获得具有较高生物活性的多功能小肽，是今后研究的主要方向。本实验采用质谱和分子对接技术，最终筛选出ACE抑制活性较强的四肽Gly-Arg-Val-Pro（GVRP）和五肽Ile-Ile-Val-Thr-Pro（IIVTP）。通过体外ACE抑制活性测定其IC50值为（84±0.06）μmol/L和（77±0.08）μmol/L；最低预测结合能分别为－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。通过分子对接技术发现GVRP、IIVTP与ACE的活性口袋S1、S1′、S2中的残基具有较强的结合力，且IIVTP可同时与S1′和S2活性口袋中多个氨基酸残基结合，这也可能是IIVTP活性强于GVRP的原因。本方法的建立为后续深度开发豆粕肽的高价值利用提供了参考与借鉴。