沙玉欢，毛晓英*，吴庆智，张 建，程卫东

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

核桃分心木（Diaphragma juglandis fructus），名核桃隔膜，简称分心木，是胡桃科核桃属植物果核内部的木质隔膜，呈弯曲不规则的薄片状，且质地脆，一般是核桃总质量的5%左右，是新疆传统维吾尔族药物之一，具有利尿清热、健脾固肾、涩精等作用[1]。核桃分心木用水煮沸后饮用，具有治疗肾虚遗精等功效。此外，长期喝分心木水泡物，对老年人的腰酸腿疼症状会有所缓解，并且有助于睡眠和提高免疫力[2-3]。核桃分心木中含有丰富的活性成分，包括黄酮、有机酸、酚类、生物碱、油脂、皂苷、挥发油、氨基酸、鞣质、糖类、多肽和其他化合物[4-5]。大量研究结果表明分心木中含有较高的黄酮类物质[1,4]。黄酮类物质是以α-苯基苯并吡喃酮为主体的一系列物质的总称，在治疗疾病和食品添加剂方面有较为广泛的应用，它不仅抑制各种自由基的产生，还可以清除人体内过多的自由基，从而间接起到延缓衰老、预防心脑血管疾病和癌症等作用[6]。目前，国内外大多对多酚类化合物的抗氧化进行研究[7]，并且以多酚混合体系研究为主，也对多酚类物质单体的抗氧化能力以及多酚单体结构与抗氧化能力的关系进行了研究[8-9]，但研究相对较少。如王鹏等[10]研究发现黑米和荞麦等杂粮多酚抗氧化能力是由多酚含量、结构中羟基数量和构型共同决定。槲皮苷和槲皮素是研究较多的黄酮物质，二者对羟自由基、超氧阴离子自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有不同程度的清除作用，DPPH自由基的清除能力最强[11]。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性，其抗氧化活性与结构有着密切的关系，不同结构（如羟基数目及位置、羰基结构和糖苷键位置等）的黄酮类化合物，表现出不同的抗氧化能力[12]。很多研究学者们对核桃分心木黄酮物质进行了研究，韩艳春[13]采用柱色谱法，从分心木中分离得到5,7,8,3’,4’-黄酮醇-3-O-鼠李糖苷。杨明珠等[14]采用硅胶柱色谱结合Sephadex LH-20柱色谱法从分心木中分离得到三种黄酮类物质，分别为柚皮素、儿茶素和二氢槲皮素。景援朝[1]和赵焕新[15]等采用反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱从分心木的石油醚提取物中首次分离得到胡桃苷A，从分心木的乙酸乙酯提取物中首次分离得到紫杉叶素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、二氢吐叶醇-9-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6’-没食子酰基)-α-D-半乳糖苷、槲皮苷。虽然很多研究学者对核桃分心木的化学成分进行了研究，但是对分心木黄酮物质的组分的系统性研究鲜见报道。本研究对核桃分心木黄酮物质进行分离纯化并对其组分进行组成分析，对其分离纯化组分进行抗氧化能力测定，以期鉴定出新的黄酮物质，同时进行黄酮物质含量与抗氧化性指标之间的相关性分析，并发现各种抗氧化指标和黄酮组分的关系。研究结果将为核桃分心木黄酮物质的组分抗氧化性及构效关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃分心木购于石河子农贸市场。

柚皮素、芦丁、异槲皮素、金丝桃苷、二氢槲皮素、儿茶素、槲皮苷、没食子酸（属多酚）标准品 北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司；NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、FeCl2、FeCl3天津福晨化学试剂有限公司；邻菲啰啉 上海弘顺生物园科技有限公司；DPPH、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 上海源叶生物科技有限公司；邻苯三酚、铁氰化钾、盐酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、盐酸天津永晟精细化工有限公司；菲洛嗪 上海恒远生物技术发展有限公司；卵磷脂（lecithos，LLS） 北京奥博星生物技术有限公司；以上试剂皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

752型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DK-8D型数显恒温水浴锅 江苏金怡仪器科技有限公司；XB 220A普利赛斯电子天平 普利赛斯国际贸易（上海）有限责任公司；GL21M型高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；DFT-100型手提式高速中药粉碎机 温岭市林大机械有限公司；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗机、标准分析筛 新乡市雷蒙特机械有限公司；RE-3000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SCIENTZ-18N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分心木黄酮物质的提取

取适量核桃分心木，置于烘箱中以55 ℃烘干2 h，再用粉碎机粉碎至粒状，过60 目筛，得到分心木粉末。分别取8 g分心木粉于300 mL离心管中，60%乙醇溶液为溶剂，料液比1∶30（g/mL）、超声功率200 W的条件下超声提取1 h。将提取液5 000 r/min离心10 min，收集上清液并且用定量滤纸过滤。将滤液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，真空冷冻干燥得固体粉末备用。

1.3.2 AB-8大孔树脂分离纯化

在上样液体积1 000 mL、上样液质量浓度2.1 mg/mL、流速1 mL/min条件下进行上样。在乙醇体积分数60%、洗脱剂体积930 mL、流速1.78 mL/min条件下进行洗脱。利用自动收集器以每10 mL为一管进行收集，并得洗脱曲线。

1.3.3 总黄酮质量浓度的测定

1.3.3.1 标准曲线的制备

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[16]获得标准曲线。准确称量10 mg芦丁标准品，用60%乙醇溶液于50 mL容量瓶定容，得0.20 mg/mL芦丁标准液。分别吸取芦丁标准溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于10 mL容量瓶中，60%乙醇溶液定容，得到质量浓度分别为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的芦丁标准溶液。6 个容量瓶中分别加入0.3 mL 5 g/100 mL NaNO2溶液，室温反应6 min，再分别加入0.3 mL 10 g/100 mL Al(NO3)3溶液，继续反应 6 min，最后加入4 mL 4 g/100 mL NaOH溶液，用体积分数30%乙醇溶液定容，室温等待15 min，摇匀，507 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁溶液质量浓度（C）为横坐标，绘制芦丁溶液的标准曲线。

1.3.3.2 分心木总黄酮的测定

分别取样品液0.1 mL，按照1.3.3.1节的方法进行反应，于507 nm波长处测吸光度。由标准曲线的拟合方程得到黄酮物质的质量浓度。

1.3.4 抗氧化能力的测定

1.3.4.1 粗提物样品预处理

分离纯化收集到的6 管样品，分别吸取0.1 mL于20 mL容量瓶中，将样品稀释200 倍进行抗氧化能力测定。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照Cheng Zhihong等[17]的方法，略有改动。以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照。DPPH用无水乙醇溶液超声溶解，配制成一定浓度（517 nm波长处吸光度为0.4～0.8）的溶液。4 mL DPPH溶液中加入4 mL样品液在517 nm波长处的吸光度记为A1；4 mL无水醇溶液中加4 mL样品液在517 nm波长处的吸光度记为A2；4 mL DPPH溶液中加入4 mL无水乙醇溶液在517 nm波长处的吸光度记为A。DPPH自由基清除率按式（1）计算：

1.3.4.3 羟自由基清除率的测定

采用邻二氮菲-Fe2+法[18]。分别吸取0.75 mmol/L邻菲罗啉和pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）1.5 mL于试管中，充分混匀后吸取0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL于试管中，再向试管中加入粗提物溶液1 mL混匀置于37 ℃水浴锅中反应30 min，反应结束后在波长536 nm波长处测定各管的吸光度为A1；其中阴性对照实验用1 mL蒸馏水代替样品溶液，再加入质量分数0.01%的过氧化氢溶液反应30 min测定吸光度记为A0；阳性对照实验用1 mL的蒸馏水代替过氧化氢溶液，测定吸光度记为A2。1 mL样品溶液同质量浓度的VC作为阳性对照。羟自由基清除率按式（2）计算：

1.3.4.4 超氧阴离子自由基清除率的测定

采用邻苯三酚法[19]。取5 mL PBS（pH 8.2）与1 mL样品溶液于试管中混合，室温（25 ℃）反应15 min，然后分别加入0.2 mL的邻苯三酚（45 mmoL/L）管中摇匀，继续反应4 min，最后用滴管加入1 滴10 mol/L盐酸溶液终止反应。在325 nm波长下测定吸光度，记为A1；0.2 mL的蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定的吸光度记为A2；用1 mL溶剂代替样品溶液测定吸光度记为A3，实验重复3 次，同质量浓度的VC作阳性对照。超氧阴离子自由基清除率按式（3）计算：

1.3.4.5 ABTS阳离子自由基清除能力测定

采用黄尚荣等[20]的方法，并略有改动。提前一天配制7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，将配好的ABTS溶液与过硫酸钾溶液按1∶0.5体积比例在锥形瓶中混匀，室温且避光反应12 h，反应产生ABTS阳离子自由基。使用前将ABTS溶液用无水乙醇稀释至734 nm波长处的吸光度大约为0.700±0.020。1 mL样品和6 mL稀释的ABTS溶液，30 ℃反应 6 min，于734 nm波长下测吸光度，记为A1。1 mL无水乙醇代替样品溶液，吸光度记为A0。重复3 次，VC作阳性对照。ABTS阳离子自由基清除率按式（4）计算：1.3.4.6 铁离子还原力的测定

参照高行恩等[21]的方法，取不同浓度的样品中1 mL于试管中，分别加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，50 ℃水浴20 min，冷却至室温，继续加入10 g/100 mL的TCA溶液2.5 mL反应片刻，等待10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1 g/100 mL的FeCl3溶液，静置反应10 min，并在700 nm波长处测定吸光度。吸光度表示铁离子还原力。VC作阳性对照。

1.3.4.7 活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基清除率的测定

称取300 mg LLS溶解于30 mL pH 7.4 PBS（10 mmol/L）中，冰浴超声溶解，得到LLS溶液。于烧杯中加入100 mL蒸馏水，并依次加入15 g TCA、0.375 g TBA和2.1 mL浓盐酸，得到TCA-TBA-HCl混液。于样品管中依次加入1.0 mL TCA-TBA-HCl混液、1.0 mL FeCl3溶液（400 μmol/L）、1.0 mL抗坏血酸（400 μmol/L）和1.0 mL样品，于37 ℃避光水浴60 min，再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl混合液，100 ℃水浴15 min，冰水浴冷却混合液至室温，2 000 r/min离心10 min，取上清液在535 nm波长处测吸光度As。以1.0 mL重蒸水代替1.0 mL样品做空白实验，具体流程同样品管，空白实验的吸光度AC[22-23]。ROS自由基清除率由式（5）计算：

1.3.5 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法测定黄酮组分

1.3.5.1 标准品和样品质量浓度

8 个标准品（柚皮素、芦丁、异槲皮素、金丝桃苷、二氢槲皮素、儿茶素、槲皮苷、没食子酸（属多酚））质量浓度分别为1、10、25、50、100、150、200 ng/mL，样品配制质量浓度为0.1 mg/mL。上样质量浓度1 μg/mL。

1.3.5.2 色谱条件

ACQUITY超高效液相色谱仪，色谱柱BEH C18（50 mm×5 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1.0 μL（10 μg/mL），最终优化流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）溶液，梯度洗脱：0～2.5 min，86% A，14% B；2.5～3.5 min，86%～70% A，14%～30% B；3.5～4.5 min，70%～58% A，30%～42% B；4.5～5.5 min，58%～5% A，42%～95% B；5.5～6 min，5%～86% A，95%～14% B；平衡2 min。

1.3.5.3 质谱条件

采用XEVO三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源，离子源温度为200 ℃，毛细管电压为2.0 kV，离子源补偿电压为50 V，脱溶剂气温度为450 ℃，脱溶剂气流量为750 L/H，锥孔气流量为150 L/H，雾化气压力为700 kPa，采用多反应检测模式扫描。

1.3.6 验证实验

由于样品中槲皮苷含量最多，并且抗氧化指标高于VC阳性对照。因此配制相同质量浓度的槲皮苷标准品、8 种现有标准品混样以及VC溶液，测定羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、ROS自由基清除率，验证某些黄酮物质的抗氧化能力可能高于VC阳性对照或者黄酮物质综合作用高于单独成分黄酮物质的抗氧化能力。

1.4 数据处理

采用Origin 7.5绘图，采用SPSS 25.0软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线

由标准曲线法得到拟合方程为：Y=11.99X－0.005 7，R2=0.995 8，芦丁标准溶液在0.01～0.05 mg/mL范围内，呈良好的线性关系。

2.2 粗黄酮物质测定结果

得到的核桃分心木粗黄酮物质的质量分数为（7.76±1.023）%。这与赵娟娟[24]研究结果相似，其在50%乙醇溶液、提取液料比1∶20.7、提取温度50.3 ℃、提取时间4 h的条件下，核桃分心木黄酮物质的质量分数为6.693%。

2.3 分离纯化洗脱曲线

由图1可知，分离纯化后收集到的黄酮物质质量浓度有明显差异。因此将第6～10管各收集为1 管，第11～15管合并收集，共收集6 管。

图1 洗脱曲线Fig.1 Elution curve

2.4 抗氧化能力测定结果

如表1所示，6 管样品中的ABTS阳离子自由基清除率、羟自由基清除率以及ROS自由基清除率出现高于VC阳性对照，原因可能与黄酮物质的组分有关，不同组分的黄酮物质之间的组合提高抗氧化能力。6 管样品中槲皮苷为主要成分，这与吕晓玲等[25]研究得出的结论相似，槲皮苷可有效清除体内超氧化物及羟自由基等，抑制脂质过氧化。

表1 分离纯化得到的6 管样品的抗氧化能力测定结果Table 1Antioxidant capacity of six flavonoid fractions

2.5 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法测定黄酮组分

如表2所示， 6 管样品测定结果显示样品中均含有柚皮素、异槲皮素、金丝桃苷、二氢槲皮素、儿茶素、槲皮苷，其中，槲皮苷含量最多。4号管含有少量的芦丁，1号和4号管含有少量的多酚。如图2～4所示，样品中除已知的柚皮素、异槲皮素、金丝桃苷、二氢槲皮素、儿茶素、槲皮苷外，还含有槲皮素、黄芪苷和表儿茶素没食子酸酯，这3 种黄酮物质首次在核桃分心木中发现并证实。如表3所示，柚皮苷含量与DPPH自由清除率和ABTS阳离子自由基清除率有显著负相关性，儿茶素含量与ROS清除率呈正相关。黄酮物质的自由基清除能力的大小与其供氢体、供氧质子等有关[26-27]。这是由于具有B—4’—OH、B—3’—OH和A—7—OH，B环具有临位酚羟基，这些结构可以提供了供氢体和供氧质子，阻断自由基的链式反应，因此这类黄酮物质具有较高的抗氧化能力。如图5柚皮素结构式，B环无邻位酚羟基，无B—3’—OH结构、C3—OH和C2＝C3结构。因此柚皮素对自由基清除率相对于其他黄酮类物质并不高，尤其是对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率的贡献并不显著，甚至产生促氧化的作用。儿茶素类物质对体内的超氧阴离子自由基、脂质自由基及脂质氢过氧自由基有较好的清除率，而对DPPH自由基清除率较弱[28]。本研究对抗氧化能力和黄酮组分相关性分析结果也证实了这一点。

表2 样品中主要物质组分质量浓度Table 2Concentrations of eight flavonoids in six samples

图2 标准品和样品中槲皮素的质谱图Fig.2 Mass chromatograms of quercetin standard and sample

图5 柚皮素化学结构式Fig.5 Chemical structure formula of naringin

表3 6 管样品中各个组分与抗氧化指标相关性分析Table 3Correlation analysis between flavonoid contents and antioxidant properties

图3 标准品和样品中表儿茶素没食子酸酯的质谱图Fig.3 Mass chromatograms of epicatechin gallate standard and sample

图4 标准品和样品中黄芪苷的质谱图Fig.4 Mass chromatograms of astragaloside standard and sample

2.6 验证实验

如表4所示，槲皮苷的ABTS阳离子自由基清除率高于8 个标准品混合样（混样），高于阳性对照VC。而槲皮苷的羟自由基清除率和ROS自由基清除率略高于阳性对照VC和混样，差异不显著。通过验证实验发现，槲皮苷有很强的ABTS阳离子自由基清除能力。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性，其抗氧化活性与结构有着密切的关系，不同结构（如羟基数目及位置、羰基结构和糖苷键位置等）的黄酮类化合物，表现出不同的抗氧化能力。一般而言，体外和细胞抗氧化实验证实具有3’,4’-邻二羟基、C3—OH、C2＝C3和C—4羰基构的黄酮化合物要比没有这些结构的黄酮物质的抗氧化能力强[29]。图6是槲皮苷的分子结构式，槲皮苷具有3’,4’-邻二羟基、C2＝C3和C—4羰基结构，因此槲皮苷具有很好的自由基清除能力的实验结果合理。

表4 8 种黄酮标品混样抗氧化能力的测定Table 4Antioxidant capacity of mixture of eight flavonoid standards

图6 槲皮苷分子结构式Fig.6 Molecular structure formula of quercetin

3 结 论

本研究对分心木黄酮物质进行提取及分离纯化，对分离纯化的核桃分心木黄酮物质进行收集，并对收集到的6 管样品进行组分分析以及6 种抗氧化指标的测定。组分分析发现除文献已报道的黄酮类物质柚皮素、芦丁、异槲皮素、金丝桃苷、二氢槲皮素、儿茶素、槲皮苷，没食子酸（属多酚）外，还含有槲皮素、黄芪苷、表儿茶素没食子酸酯，其中6 管样品中槲皮苷含量最多，芦丁与没食子酸含量最少甚至不存在。抗氧化能力测定结果与黄酮组分和含量相关性分析结果显示，柚皮苷含量与DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率呈现负相关，即柚皮素组分对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除活性较低，由于自身结构原因，可能反而产生促氧化的作用。儿茶素对ROS自由基有很好的清除效果，对DPPH自由基清除效果不好。并且槲皮苷有很强的ABTS阳离子自由基清除率。实验结果进一步证实了具有B—4’—OH、B—3’—OH和A—7—OH，B环具有临位酚羟基，3’,4’-邻二羟基、C3—OH、C2＝C3和C—4羰基等结构可以提高黄酮化合物抗氧化活性。研究结果为柚皮苷、儿茶素和槲皮苷的抗氧化能力及其构效关系的研究奠定基础，也为核桃副产物的加工利用提供提供了理论依据。