牛文君

(郑州澍青医学高等专科学校，郑州 450064）

0 引 言

乳源性运动营养品是指以牛乳为主要原料制成的针对运动人群开发的一类补充蛋白质元素的食品[1]，在近些年开始越来越流行。随着需求量的大增，促使上游养殖环节能够缩短饲养的周期，提高饲料转化率等[2-3]，而激素的使用能达到上述的效果。所以畜禽在饲养过程中易受到多种人工激素滥用的影响[4-5]，如雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮等，这也导致激素残留问题影响到消费者的食品安全，因此有必要建立一种检测含乳源性食品中激素残留的方法，特别是对运动员这类特殊人群的运动营养品中激素残留的筛查检测，评价此类食品的安全具有重要意义。

乳源性食品中检测激素方法有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法以及高效液相色谱-质谱联用法[6-9]。薄层色谱法对检测仪器及人员要求较低，但是此方法精度较差、实验步骤冗长繁多、重现性不好[10]；酶联免疫吸附试验法具有灵敏、快速等优点，但是存在交叉污染反应的缺点[11]；高效液相色谱法的检测稳定性较好，但样品前处理过程繁琐，且采用的免疫亲和柱成本较昂贵[12]。鉴于上述方法存在的前处理中有些步骤和条件的缺陷，或者易定性误判等不足，本研究运用SPE前处理净化技术，简化提取过程，缩短时间，并依据质谱检测器具有特异选择性以及高灵敏度的特性，尝试建立了SPE净化技术结合HPLC-MS/MS法检测乳源性食品中雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5种激素的方法，方法灵敏度高、重现性好，降低了检测成本、提高了检测效率，可作为乳源性运动营养品中激素的分析和监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；API 3500 QTrap超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，美国AB公司；雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮标准物质购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 样品来源

样品均为随机购买的市售乳源性运动营养品。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

本试验的色谱柱选用Zorba-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，3μm)；进样量为2μL；流速为0.15 mL/min；柱温为30℃；流动相为A：0.20%甲酸溶液，B：乙腈；洗脱条件见表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脱条件

1.3.2 样品的提取与净化

称取2.0 g样品加入20 mL提取溶液，超声提取10 min，离心后取上清液。取2 mL上清液再进行固相萃取，步骤为：依次用2 mL甲醇和2 mL水活化SPE小柱，然后上样，再选用5 mL水和5 mL甲醇进行淋洗，最后用5 mL 5%氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液氮气吹干后用2.0 mL乙腈溶解，过滤膜后上机测定。

1.3.3 标准曲线的建立

吸取10μL的5种激素的标准溶液，用甲醇定容到10.0 mL配制成100.0 ng/mL的中间液，再配制成1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL一系列标准溶液，经仪器进行分析，绘制标准曲线。

1.3.4 方法的精密度、重复性与回收率

以未检出5种激素的乳源性运动营养品为空白基质，加入3个梯度的混合标液，使用SPE小柱提取后，上机检测计算回收率。

2 结果与分析

2.1 提取溶液的选择

参考相关文献[13-15]，5种激素组分属碱性物质，故选择中性或者偏酸性溶液提取。本实验分别比较∶提取溶液Ⅰ（纯甲醇溶液）、提取溶液Ⅱ（V甲醇：V水=1∶1、提取溶液Ⅲ（V0.2%甲酸∶V甲醇∶V水=10∶80∶10）、提取溶液Ⅳ（V甲醇∶V0.2%甲酸=90∶10），分别提取加标样品中的目标物，记录下目标物峰面积，分析不同类型的提取溶液对激素提取的影响，结果见图1。

图1 4种提取溶液对激素回收率的影响

由图1可知，提取溶液Ⅳ的提取效果整体优于其他3种提取溶液的效果最优，5个目标组分的峰面积最高，这与激素的碱性化合物性质有关，在此比例的偏酸性提取溶液条件下，目标物在提取液中的分配系数高，实现较满意的提取效果，不同提取溶液间目标组分的峰面积差异显著(P＜0.05），所以选择甲醇-0.2%甲酸（体积比90∶10）比较适合进行下一步的实验方案。

2.2 SPE柱的选择

由于激素的化学结构中具有含氮碱性中心，其在弱酸或者碱性条件下能离子化成为分子[16]，实验对比了已经商品化了的HLB、PCX以及MCX 3款固相萃取小柱的做净化效果对比，记录下目标物峰面积，分析不同类型的SPE柱对5种激素提取的影响，结果如图2所示。

图2 5种激素经不同SPE柱处理后的比较

由图2可知，MCX小柱回收率最好，5个目标组分的峰面积最高，且不同类型SPE柱间目标组分的峰面积差异显著(P＜0.05），因此选择MCX小柱进行固相萃取净化。且对60 mg/3 mL和150 mg/6 mL两种规格的MCX小柱进行比较，发现对5种激素都有非常好的保留，回收率没有明显差异，从节省成本的角度考虑，60 mg/3 mL小柱更为合适。

2.3 流动相的选择

在流动相选择中，比较了纯乙腈、乙腈-水（体积比1∶1）、纯甲醇、甲醇-水（体积比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸（体积比1∶1）和乙腈∶0.20%甲酸（梯度洗脱）作为流动相条件下激素检测灵敏度及出峰情况。结果发现，流动相中没有甲酸存在的情况，如：纯乙腈、乙腈-水（体积比1∶1）、纯甲醇和甲醇-水（体积比1∶1）流动相条件下，5种激素的电离效果较差，出现峰拖尾、峰型对称性差、灵敏度下降等情况。而选择乙腈-0.20%甲酸（梯度洗脱）为流动相则得到改善，因此选用乙腈-0.20%甲酸作为流动相。又因运动营养品中基质干扰较大，在流动相条件中设置梯度条件可避免样品中的基质干扰，使得目标组分的定性和定量更加准确，可以获得较好的实验结果（图3）。

图3 5种激素的多反应监测（MRM）色谱图

2.4 质谱条件的选择

用质量浓度分别为雌酮10.0μg/mL、已烯雌酚0.5μg/mL、双烯雌酚0.5μg/mL、己烷雌酚0.5μg/mL、孕酮0.1μg/mL的混合标准溶液，对目标物进行一级和二级质谱扫描，并优化质谱参数。5种目标物的质谱分析参数见表2，包括目标物的母离子精确质量数，碎片离子的精确质量数以及去簇电压和碰撞电压参数。

表2 5种激素的多反应监测扫描模式的质谱参数

2.5 方法的线性范围与灵敏度

在乙腈-0.20%甲酸流动相体系中，以表1梯度洗脱的步骤，按1.3.4实验步骤配制5种激素的标准溶液，绘制标准曲线。结果表明：5种激素在一定线性范围内均具有良好的线性关系，5种激素的检出限（LOD）范围为0.3～6.5μg/kg，定量限（LOQ）范围为1～20μg/kg，结果见表3。

表3 5种激素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.5 方法的精密度、重复性与回收率

在加标回收实验中，分别选用液态和固态2种基质形态的乳源性运动营养品，分别添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的三个水平混合标准品，每个结果测定5次，进行加标回收的试验。

由表4可见，在2种不同的形态基质样品中，5种激素的加标回收率为82.3%～106%，精密度为2.11%～5.67%，说明本实验的检测数据的准确度和精密度可行。

表4 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

3 结 论

本文建立了一种SPE-HPLC-MS/MS检测乳源性运动营养品中5种激素残留的分析方法。实验结果表明，样品由甲醇-0.2%甲酸（体积比90∶10）进行提取后，经60 mg/3 mL的MCX固相萃取小柱净化处理后，可有效去除样品中的干扰物对目标峰的影响，实现对5种激素组分的净化，在质谱检测器的多反应监测模式下，可实现同时对样品中雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5种激素的定性和定量分析。试验建立的方法加标回收率范围为82.3%～106%，相对标准偏差在2.11%～5.67%之间，具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测乳源性食品中的5种激素的含量，可为乳源性运动营养品中雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮的分析和监控提供技术支持。