武彬，柏泽柳，张健，郭传会，张道雷

(山东职业学院 生物工程系，济南 250104)

0 引 言

凝乳酶是制作乳酪必需的酶制剂[1]，还用于儿童消化不良的临床治疗[2]，其对热敏感，易失活[3]。多羟基化合物作为酶稳定剂操作简便、适用范围广，应用最为广泛[4-6]。荧光光谱常用于研究蛋白质分子构象变化。氨基酸残基所处微环境极性增加则荧光强度降低、发射峰红移，疏水性增加则荧光强度升高、发射峰蓝移[7]。多羟基化合物的种类、浓度等对酶热稳定性影响的研究大多集中于单一成分对酶的保护作用[8]。少量保护剂配方优化的研究中，多羟基化合物是过量添加的，而且各实验组总浓度并不一致[9]。因此，有必要分析不同多羟基化合物的热保护作用是否存在协同效应，为蛋白酶制剂热稳定剂配方优化提供参考。

1 实 验

1.1 材料与仪器

凝乳酶，北京多艾特生物科技有限公司进口分装，使用前用磷酸缓冲液透析平衡去除小分子，其余为分析纯；岛津RF-6000荧光分光光度计；山东职业学院生物技术研发中心自有仪器。

1.2 凝乳酶活力的测定方法

凝乳酶活力测定采用Arima法[10]，酶活力测定采用0.02 mol/L pH 6.0 K2HPO4-KH2PO4缓冲体系，底物脱脂牛乳溶液中CaCl2浓度为1.0%。

1.3 荧光光谱分析

采用岛津RF-6000荧光分光光度计以波长扫描方式测定荧光发射光谱，设定激发光为295 nm，发射光扫描范围为305～500 nm，激发光和发射光狭缝校正宽度均为5 nm，扫描速度为6 000 nm/min。

1.4 凝乳酶热处理

配置600 U/mL（用于残余酶活力测定）或质量浓度1 mg/mL（用于荧光光谱）凝乳酶溶液或含有不同质量浓度葡萄糖、海藻糖、甘油或其混合物的凝乳酶溶液，放入54℃水浴锅中立即开始计时，水浴一定时间，立即转入冰水中快速降温至0℃，测定残余酶活力或荧光光谱。

1.5 多羟基化合物混合溶液的配制

凝乳酶磷酸缓冲溶液和总质量分数5.0%葡萄糖、海藻糖和甘油混合溶液的凝乳酶磷酸盐缓冲溶液共22组，测定54℃热处理15 min前后各组样品荧光发射光谱。多羟基化合物的配置情况如表1所示。

表1 多羟基化合物混合溶液的组成 %

1.6 数据处理

采用Graphpad Prism 4.0软件，进行酶活力数据的统计分析、线性回归分析与荧光发射光谱差谱305～369 nm曲线下面积(Area under curve,AUC305nm-369nm)计算；采用Excel2007进行葡萄糖、海藻糖和甘油混合物对热处理凝乳酶残余酶活力和荧光光谱差谱的AUC305nm-369nm进行三元线性回归分析。统计分析结果以P＜0.01作为差异极显著的判断标准。

2 结 果

2.1 多羟基化合物质量分数对残余酶活力的影响

图1为葡萄糖、海藻糖和甘油质量分数对凝乳酶热稳定性影响的结果。配制一系列分别含质量分数0～5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油的凝乳酶溶液，54℃保温15 min，测定其残余活力并与多羟基化合物的质量分数拟合线性方程，其斜率分别为13.080±0.542，8.525±0.492和5.419±0.406（R2＞0.98）。因此，上述3种多羟基化合物对凝乳酶的保护作用从强到弱依次为葡萄糖＞海藻糖＞甘油。

图1 葡萄糖、海藻糖和甘油质量分数对凝乳酶热稳定性的影响

2.2 多羟基化合物对热处理凝乳酶荧光光谱的影响

选取葡萄糖作为研究对象，探讨其对热处理凝乳酶荧光光谱的影响。图2（a）为不同热处理时间下含5.0%葡萄糖的凝乳酶溶液的荧光发射光谱，不含糖的酶溶液为对照样。未经热处理的含糖凝乳酶荧光发射峰略低于凝乳酶。随着热处理时间延长，含糖组的荧光强度显著高于对照组。热处理30 min，凝乳酶分子结构接近完全松散，两组荧光强度又趋于一致。图2(b)为含糖凝乳酶与其对照样的荧光差谱图。

图2 葡萄糖对热处理凝乳酶荧光光谱的影响

2.3 多羟基化合物对凝乳酶热稳定性作用

将凝乳酶分别溶于磷酸缓冲液和总质量分数为5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油的多羟基化合物混合溶液共22组，分别测定其热处理后的残余酶活力和热处理前后的荧光发射光谱。各组热处理前后的荧光发射光谱及差谱如图3所示。图3（a）为不同构成的多羟基化合物对凝乳酶热处理前后荧光发射光谱的影响，图3（b）为其差谱。

图3 多羟基化合物混合溶液的组成对热处理凝乳酶荧光光谱的影响

荧光光谱的差谱可以反映酶分子结构变化情况。各组荧光差谱在305～369 nm为正值，为减少实验误差，以该波长范围内荧光差谱的曲线下面积AUC305nm-369nm为指标，表征凝乳酶的结构变化。与酶活力变化的结果相结合，可以分析凝乳酶结构和功能的变化情况。表2显示了多羟基化合物对热处理凝乳酶残余酶活力与荧光发射光谱的影响结果，其中残余酶活力每组4个重复，统计标准误差（Standard Error of Mean,SEM）。

表2 不同多羟基化合物组合对凝乳酶残余活力和荧光差谱曲线下面积的影响

以表1中葡萄糖、海藻糖和甘油质量分数作为X1，X2和X3，分别以残余酶活力和荧光差谱AUC305nm-369nm为Y1和Y2，拟合三元线性方程，统计分析结果显示，两组方程的R2值分别为0.8898和0.9266，标准误差分别为5.1616和26317。三元线性回归分析结果见表3，3种多羟基化合物浓度对热处理凝乳酶的残余活力和荧光光谱差谱的影响均极显著（P＜0.01）。

表3 多羟基化合物组成对热处理凝乳酶活力和荧光差谱三元线性回归分析结果

3 讨 论

3.1 多羟基化合物浓度与凝乳酶热稳定性的线性关系

关于葡萄糖、海藻糖和甘油对凝乳酶热稳定性的作用显示，在0～5.0%的浓度范围内，其保护作用与浓度都呈线性相关。这与Tapati等关于多羟基化合物浓度对酶热稳定性影响的研究结果一致，即高浓度下多羟基化合物对酶的保护作用趋于某一限值，而低浓度下多羟基化合物的热保护作用与其添加量成正比[1]。关于稳定剂对酶的保护机理大多是在海藻糖的研究结果上提出的，包括玻璃态假说，水替代假说和优先排阻假说等[11]。氢键和疏水作用是维持酶分子三维构象的主要作用，多羟基化合物中的羟基与水分子形成大量氢键，在蛋白质分子周围形成一个由氢键连接起来的水化层，使水分子结构更加有序，同时也可以增强非极性基团之间的疏水相互作用，从而提高了蛋白质分子的稳定性[11-15]。低浓度下，多羟基化合物形成的水化层强度和厚度也随其浓度提高而增加。利用该特性，只需比较混合溶液中各组分保护效果的简单加和与实测的凝乳酶活力是否存在较大差异，即可确定多羟基化合物混合溶液中各成分对凝乳酶热稳定性的影响是否存在相互作用。

3.2 多羟基化合物对凝乳酶分子结构的影响

表4中关于葡萄糖对热处理凝乳酶荧光发射峰影响显示，随着热处理时间的延长，凝乳酶荧光发射峰的位置红移，强度降低。Trp荧光光谱最大发射峰的变化，可推断蛋白质构象变化的信息。Trp作为高度疏水的基团，常位于蛋白质分子内部。蛋白质变性过程中，其内部的疏水氨基酸逐渐向外暴露，荧光发射峰的强度会显著降低，发射峰的位置也会不断红移。当Trp残基处于疏水性环境中时，其荧光发射峰在330～332 nm。随着蛋白质三级结构的逐渐松弛，Trp残基逐渐暴露于水相中，其荧光发射峰强度逐渐降低，最大发射波长λmax也逐渐红移至350～352 nm[16]。表4的结果显示，含葡萄糖组凝乳酶荧光发射峰的强度和位置的变化幅度均低于对照组，表明加入葡萄糖能显著的提升凝乳酶分子构象的稳定性。

表4 葡萄糖对热处理凝乳酶荧光发射峰的影响

3.3 混合多羟基化合物对凝乳酶保护作用

以三元线性回归分析总浓度5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油溶液对凝乳酶的保护作用，发现葡萄糖、海藻糖和甘油的混合溶液对凝乳酶的热保护效果与三者同浓度下单一组分作用效果之和基本一致，表明实验浓度范围内3种多羟基化合物对凝乳酶的热稳定作用基本无相互影响。这可能是由于，在多羟基化合物浓度较低时，蛋白质周围的水化层尚未饱和，因此混合溶液中各种多羟基化合物都能与凝乳酶周围的水分子形成氢键，起到提升蛋白质稳定性的作用[13-14]。而以酶活力和两个三元线性回归方程中3个X变量的比值也基本相当，则体现了多羟基化合物提高凝乳酶热稳定性对催化活力与分子构象作用效果的一致性。

4 结 论

在0～0.5%的质量分数下，多羟基化合物的浓度与凝乳酶残余活力正相关，同质量分数下对凝乳酶的保护效果：葡萄糖＞海藻糖＞甘油。多羟基混合溶液中各化合物对凝乳酶的保护效果接近其混合溶液单独作用效果的总和，表明较低浓度下，混合溶液中多羟基化合物间相互作用较弱或无相互作用。热处理后凝乳酶荧光发射峰红移，发射强度也明显降低，加入多羟基化合物后，发射峰红移和发射强度降幅有所减少。该结果提示热处理导致凝乳酶分子结构变得更加松散，而多羟基化合物具有稳定凝乳酶分子三维构象的作用。以残余酶活力和荧光差谱AUC305nm-369nm为因变量的三元线性方程，其自变量的回归系数分别为13.229：9.595：4.819和-79489：-63257：-33959，回归系数比例较为接近，说明多羟基化合物对凝乳酶的热稳定作用在分子结构与催化功能方面的效果是一致的。