姚明奇，斯琴朝克图，吴菘建，戴余军，姜益泉，张杨，章爱群,3

（1.湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心，湖北孝感 432000；3.生态毒理与食品安全研究中心，湖北孝感 432000）

0 引 言

硫氰酸钠（Sodium Thiocyanate，STC）是一种具有杀菌作用的添加剂[1-4]，进入人体后释放氰根离子，使组织出现氧利用功能性障碍[5]，超量STC还会阻碍人体对碘的吸收[6-7]。因此，世界各国严禁在牛奶中添加或限量添加STC[8-9]。我国“2015年食品安全抽检监测项目参考值”中规定，液体乳中SCN含量的参考值为10 mg/kg[10-12]。STC的常用检测方法，如高效液相色谱法[13]、气相色谱-质谱法[14]、离子色谱法[15]、表面增强拉曼光谱[16,-17]、离子色谱或离子色谱-质谱联用仪[18-21]等，具有前处理方法复杂、仪器设备昂贵，不适合现场操作的缺点。本文选择紫外-可见分光光度法和目视法两种快速检测方法，通过单因素筛选、正交设计等方法改进和优化，旨在为中小企业和监管部门提供检测灵敏度高、结果稳定、操作简便快速、价格便宜的检测方法，提高检测效率，减少商家损失。

1 实 验

1.1 仪器与设备

T 9CS型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；TG16G型低速台式离心机，上海赵迪生物科技有限公司；FA1004N型电子天平，上海菁华科技仪器有限公司；XMTD-8222型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Direct-Q 3超纯水系统，美国密理博（Millipore）公司；JOYN-30AL型智能超声波清洗机，上海乔跃电子有限公司；常用玻璃仪器，在使用以前均于盐酸与硝酸混合液中浸泡过夜，在超声波清洗器中洗净，用去离子水冲洗3次备用。

1.2 药品与试剂

牛奶，市售。

STC（分析纯），上海山浦化工有限公司；十二水合硫酸铁（Ⅲ）铵（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；三氯化铁（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；硫酸铁（分析纯），天津博迪化工股份有限公司；硝酸铁（分析纯），山东西亚化学股份有限公司；水合高氯酸铁（分析纯），源叶生物有限公司；硝酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；硫酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；高氯酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；结晶紫（分析纯），中国远航化工厂；三氯乙酸（分析纯），上海麦克林化学试剂有限公司；过氧化氢（质量分数为30%，分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；乙醇（体积分数为95%，分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

STC标准溶液（0.1 g/L）：精密称取STC 10.00 g，将其放于电热鼓风干燥箱内105℃烘干至恒重，取出密封保存。精密称取恒重后的STC 1 000 g，用少量超纯水溶解并转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，摇匀，得STC母液（1 g/L）。再精密量取STC母液10 mL，转移至100 mL容量瓶中并用超纯水定容至100 mL，摇匀，得STC标准溶液（0.1 g/L），于4℃冰箱保存。

硝酸（1∶6）：量取1体积的浓硝酸（体积分数为65%～68%）与6体积的超纯水水加入500 mL容量瓶中，摇匀。

铁盐溶液（质量浓度160 g/L）：分别精密称取硫酸铁铵，三氯化铁，硫酸铁，硝酸铁，高氯酸铁16.00 g，加入少量水溶解，再滴加1 mL各铁盐酸根相对应的酸。转移至100 mL容量瓶中并用超纯水定容至100 mL，摇匀。

三氯乙酸溶液（质量浓度100 g/L）：精密称取三氯乙酸100.00 g，加入适量超纯水溶解，再将溶液转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，摇匀。

过氧化氢溶液（质量分数1%）：用移液管量取过氧化氢溶液（质量分数30%）3.33 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水定容至100 mL，摇匀，于4℃冰箱保存。

结晶紫指示剂（质量浓度1 g/L）：精密称取结晶紫0.100 g，用少量体积分数95%乙醇溶解并转移至100 mL容量瓶中，用超纯水定容至100 mL，摇匀。

1.3 紫外-可见分光光度法

本方法是在公开发表的相关文献[15-24]基础上，选择文献方法中重复率较高，具有一定代表性的不同因素、不同水平和操作步骤作为模板，通过单因素筛选和正交实验优化确定最优条件。

检测波长的确定：取STC标准液10 mL加入硝酸1 mL酸化，加入显色剂硫酸铁铵溶液1 mL，反应5 min，定容至25 mL。用紫外-可见分光光度计在400 nm～900 nm波长范围内扫描，确定STC的最大的吸收波长为451 nm。

操作步骤模板：精密量取牛奶10.0 mL置于50 mL离心管中，再精密量取超纯水10.0 mL置于另一只同规格的离心管中。每管中分别加入三氯乙酸溶液30 mL和过氧化氢溶液0.5 mL。用电热恒温水浴锅于60℃水浴加热5 min。待溶液冷却后，3 500 r/min转速离心5 min，取上清液于4℃冰箱分别保存。超纯水（空白）和样品上清液各取10 mL置于25 mL容量瓶中，加入硝酸1 mL酸化，用铁盐溶液1 mL显色后，反应5 min，用超纯水定容。以空白液调零，用紫外-可见分光光度计于451 nm处测量吸光度。

标准曲线的绘制：准确量取STC标准溶液（质量浓度0.1 g/L），用超纯水配制成质量浓度梯度分别为0，0.5，1，2，4，8，16μg/mL的STC系列标准溶液。分别从上述7个STC系列标准溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，编号1～7，每瓶加入硝酸1 mL酸化，再分别加入显色剂铁盐溶液1 mL，反应5 min，用超纯水定容。1号管作为空白对照，用紫外-可见分光光度计于451 nm处平行测定3次。以STC质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（Abs）为纵坐标，绘制标准曲线。

检出限：取上述操作步骤模板中的空白溶液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加入硝酸1 mL酸化，然后加入显色剂硫酸铁铵溶液1 mL，反应5 min，用超纯水定容至25 mL。用紫外-可见分光光度计于451 nm处测定吸光度，共测定20次。依据公式LOD=+K×SD（x—平均数；SD—标准偏差；K—常数，取3）计算仪器检出限LOD，此公式适用于各种光学分析方法。

准确度与精密度：向牛奶样中加入适量STC标准溶液，使其质量浓度分别为高质量浓度组0.05，0.10，0.15 g/L和低质量浓度组0.005，0.010，0.015 g/L。采用上述操作步骤模板制备样品，用紫外-可见分光光度计检测，回收率采用单点校正法计算。同一天内每个质量浓度5个平行，计算日内相对标准偏差，每种样品重复5 d，计算日间相对偏差。检测时未加标样品作为空白对照，减除背景值，计算其回收率。计算公式：回收率/%=（加标液质量浓度-空白样品质量浓度）/加标液质量浓度×100%。

单因素实验：本文对液态中STC残留UV-VIS快速检测方法的不同操作条件进行了单因素实验设计筛选。按照上述操作步骤模板作为基础，对三氯乙酸质量浓度、离心机转速、硝酸的用量、显色剂种类和用量、显色时间等条件，每次只改变相应单因素变量，其它条件不变时，测定吸光度确定最合理的水平，3次平行测定。各单因素变量设计如表1所示。

表1 牛奶中STC残留的UV-VIS快速检测方法单因素变量设计

正交实验：为了进一步优化实验条件，在单因素实验结果基础上，针对液态奶中STC残留UV-VIS快速检测方法进行4因素4水平（L16(44)）正交实验，结果如表2所示。以标准步骤模板为基础，按照正交实验表每个实验序号相应的三氯乙酸质量浓度、离心机转速、显色剂用量和硝酸用量进行优化，平行操作3次。

表2 牛奶中STC残留UV-VIS快速检测方法的L16(44)正交实验设计

1.4 目视比色法

标准比色卡的制作：准确量取STC标准溶液（质量浓度0.1 g/L），用超纯水配制成质量浓度梯度分别为0，2，5，10，20，50，100μg/mL的STC系列标准溶液。分别从上述7个STC系列标准溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，编号1～7，分别加入硝酸1 mL酸化，再分别加入显色剂三氯化铁溶液1 mL，反应5 min，用超纯水定容，三组平行操作。选颜色区别最为明显的一组溶液作目视比色法的标准比色卡。

目视比色牛奶样品制备：精密量取牛奶10.0 mL置于50 mL离心管中，加入三氯乙酸溶液30 mL和过氧化氢溶液0.5 mL。用电热恒温水浴锅60℃水浴加热5 min。待溶液冷却后，3 500 r/min转速离心5 min。取上清液于4℃冰箱保存。取上清液10 mL，加入硝酸1 mL酸化，加入显色剂硫酸铁铵溶液1 mL，反应5 min。与标准比色卡对比，获得牛奶中所含STC含量区间。

显色剂的选择：准备牛奶样品6份，分别命名为A1，A2，B1，B2，C1，C2；其中显色剂A为三氯化铁作为显色剂，B为硝酸铁作为显色剂，C为硫酸铁铵作为显色剂，1为空白，2为加标STC至质量浓度为10μg/mL，目视对比显色剂的显色优劣。

指示剂的选择：按目视比色法标准步骤准备比色卡，再准备牛奶样品两份，其中一份不加标，一份加标STC至质量浓度为10μg/mL。依照上述标准操作步骤操作时，在滴加显色剂之前分别加入所选两种指示剂罗丹明B和结晶紫几滴，目视对比两种指示剂显色优劣。

STC含量计算公式为

STC质量浓度=(CV2V4)/(V1V3)，

式中：C为待测液中STC的质量浓度（μg/mL）；V1为量取样品的体积（mL）；V2为上清液的总体积（mL）；V3为添加的上清液体积（mL）；V4为待测液总体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 紫外-可见分光光度法的优化

标准曲线与线性关系：在不同显示剂条件下每个试样平行操作3次，取其平均值，并绘制标准曲线，其标准曲线回归方程与相关系数结果如表3所示。结果表明，在设定质量浓度范围之内有着良好的线性关系和相关性，满足本文定量分析要求。

表3 不同显示剂条件下的STC标准曲线回归方程与相关系数

仪器检出限：采用UV-VIS方法于451 nm处测定空白样品20次，其数据如表4所示。根据本文1.3所示检出限计算公式可确定本方法检出限（LOD）为2.699 g/mL。

表4 UV-VIS方法在451 nm波长处测定空白牛奶中STC残留质量浓度

回收率与精密度两组牛奶中6个质量浓度STC添加回收率如表5所示。结果表明，高质量浓度范围内回收率在92.64%～98.88%之间，RSD为0.4447%～2.452%；低质量浓度范围内回收率在93.63%～95.47%之间，RSD为3.763%～6.797%。均可满足定量分析方法需要。

表5 STC在牛奶中的添加回收率（n=3）

单因素筛选：首先通过不同单因素变量对STC在牛奶中的回收率或吸光度，比较单一因素变化时其含量检测的影响。实验结果表明，添加不同显色剂时，硫酸铁与牛奶上清液形成很深的底色，严重干扰检测结果，故排除硫酸铁作为显色剂的可能。添加其它显色剂时STC在牛奶中的回收率顺序为高氯酸铁（99.19%）＞硫酸铁铵（98.83%）＞硝酸铁（98.11%）＞三氯化铁（97.52%）。高氯酸铁的市场价格远高于硫酸铁铵，且高氯酸铁与硫酸铁铵的回收率差异较小，故本实验选择硫酸铁铵作为优选显色剂。

三氯乙酸质量浓度、离心转速、硝酸的用量、显色剂的用量、反应时间等变量对吸光度的影响如图1所示。因牛奶中的蛋白质影响吸光度的测定，故本方法采用三氯乙酸去除牛奶中蛋白质。在其它处理条件相同时，仅改变三氯乙酸的质量浓度，样品溶液的吸光度在三氯乙酸质量浓度为100 g/L时达到顶峰，并随着三氯乙酸质量浓度的上升而逐渐下降。沉淀牛奶中的蛋白质时如果采用过滤方法，则造成大量溶液损失，故本方法采用离心法。实验结果表明，溶液的吸光度随着离心转速的增大而增大，在离心转速达到4500 r/min时达到了顶峰，之后又开始下降。硫氰酸根在酸性的条件下与铁离子络合形成血红色的硫氰酸铁，需添加硝酸提供氢离子进行酸化。实验结果显示，当硝酸用量达到1 mL时，吸光度最高。随着硝酸用量的增加而吸光度逐渐降低。需要说明的是，配备显色剂时滴加的铁盐导致未加硝酸的溶液依然在451 nm处有一定的吸光度。关于显色剂的用量，当显色剂滴加到1 mL时，样品吸光度达到最高点。之后随着显色剂用量的增加而吸光度不断降低。同时，空白对照试剂的颜色随着显色剂用量的增加而加深。因为，铁盐溶液本身有颜色，会随着显色剂的增加底色不断加深。样品中各种化合物添加后，反应时间的优化是从2 min开始逐渐增加到30 min。实验结果表明，反应时间2 min时吸光度最高，5 min之后下降较为明显。操作过程中发现2 min的反应时间过短，不易操作。因此，5 min作为反应时间较为合适。

图1 不同实验条件对UV-VIS吸光度（Abs）的影响

正交实验：通过单因素筛选实验，确定硫酸铁铵作为优选显色剂，显色时间为5 min。因此，本文主要针对三氯乙酸质量浓度、离心机转速、显色剂用量和硝酸用量进行正交实验优化。正交实验条件、因素、水平及相应序号见表6，正交实验直观分析结果如表7所示。结果表明，各水平平均数的差值R的绝对值从大到小依次为RC＞RB＞RD＞RA。即，对实验影响最大的是显色剂的用量，其次是离心转速，而硝酸用量和三氯乙酸的质量浓度影响较小。

表6 正交实验条件的因素和水平相应序号

表7 牛奶中STC残留UV-VIS检测方法的正交实验结果

对正交实验表6进行方差分析（如表8所示）后的结果表明，三氯乙酸质量浓度，离心转速，显色剂的用量，硝酸用量等4种变量的F值均大于F0.05，处理间的差异达到了显著水平。三氯乙酸质量浓度和硝酸用量的F值大于F0.01，处理间的差异达到了极显著水平。通过正交实验结果获得A1B2C2D2组合实验结果最佳。但单因素实验结果显示，最佳对应条件分别 为A2、B3、C2和D3。因此，通过进一步增加了A2B3C2D3组合和A1B2C2D2组合对比实验。结果表明，A2B3C2D3组合实验结果更优，且更加稳定可靠。即样品前处理时用100 g/L的三氯乙酸沉淀蛋白质，4 500 r/min的转速离心，取上清液滴加硝酸1 mL酸化，再滴加显色剂硫酸铁铵1 mL，显色反应5 min，检测波长为451 nm。

表8 正交实验结果的方差分析

2.2 目视比色法的优化

目视比色法的标准比色卡如图2所示。图中标号1～7比色管中STC质量浓度分别为0，2，5，10，20，50，100μg/mL。结果表明，比色卡的颜色从1～7逐渐加深，最终变成橙红色。因此，经过处理后的牛奶样品，以其颜色深浅判断牛奶中STC质量浓度是否超标。未处理的牛奶中也有一定量的氰酸钠存在，但牛奶行业普遍规定牛奶中STC的质量浓度不得超过10μg/mL，既样品颜色深于图4中4号管的颜色时可判断为实样中的STC的质量浓度超过规定限量。

图2 目视比色法标准比色卡

在显色剂优化实验中，本文选用三氯化铁、硝酸铁、硫酸铁铵作为考察显色剂，对比3种显色剂的颜色显示对比度。结果表明，硝酸铁作为显色剂时颜色对比度更明显，易于目视法判断STC在牛奶中的质量浓度是否超过规定限量10μg/mL（如图3所示）。

图3 牛奶中STC目视法检测的不同显色剂的选择

不同指示剂的对比实验结果表明，当比色卡和牛奶试样中均不加指示剂时如图4（a），试样中STC质量浓度在10μg/mL左右或不超过超过20μg/mL情况下颜色对比度可用目视法判断。当以结晶紫作为指示剂时如图4（b），牛奶样品溶液的不同质量浓度颜色差异显示更加明显，低于STC质量浓度100μg/mL时均能判断大致质量浓度区间。

图4 牛奶试样中不滴加指示剂（a）和滴加结晶紫指示剂（b）后的对比

3 讨 论

此前，UV-VIS方法检测不同介质中STC残留研究显示，大部分都利用硫氰酸根（SCN-）在酸性条件下和Fe3+络合生成血红色络合物硫氰酸铁[10,22-27]。报道中操作步骤各有特点，所选用试剂各异，检测波长也不同。2009年，水明等[23]用三氯乙酸沉淀蛋白质，超声提取后用中速滤纸过滤得上清液，向上清液中加入三氯化铁显色剂，于457 nm波长处测定STC的含量。此后伍金娥等[24]和付冬梅等[25]也进行了三氯化铁显色剂的比色实验，检测波长为455 nm。2010年，李卫群等[26]对方法进行了优化，在样品中加入三氯乙酸溶液和双氧水，将溶液置于60℃水浴进行蛋白质沉淀后，离心分离蛋白质，取滤液加入硝酸酸化，与硫酸铁铵显色反应，在465nm处测定吸光度计算STC含量。2012年，陈慧珠等[27]选用了另一种方法进行测定，即将牛乳样品处理过后，在50℃中性磷酸盐缓冲液的条件下，硫氰酸根会与氯胺T（Chloramine T）反应生成氯化氰，再和异烟酸反应生成戊烯二醛，最后与吡唑啉酮缩合生成蓝色染料，在638 nm测定吸光度。2019年，Silva Júnior等[28]用微泵多换向流系统成功地应用于硫氰酸根的测定，并鉴别吸烟者与非吸烟者唾液样本进行鉴别分析，检测波长为480 nm。STC含量检测中离子色谱方法是一种监督检查使用的常用方法。虽然，其结果可靠、稳定性好，但检测周期长、前处理复杂、费用较高。如，中华人民共和国农业行业标准，生乳中硫氰酸根的测定离子色谱法[29]及叶巧燕等[21]建立的离子色谱方法检测生乳中硫氰酸根的方法的前处理方法均需要过滤、反向净化小柱净化等复杂且耗费较大的步骤。

本文在上述文献基础上进行比较和谨慎对比，并通过对不同添加方式、试剂种类和用量等条件进行单因素筛选、正交设计等方法改进和优化，最终确定了鲜牛奶中STC残留UV-VIS检测方法。本方法的前处理用100 g/L的三氯乙酸沉淀蛋白质，4 500 r/min的转速离心，取上清液滴加硝酸1 mL酸化，再滴加显色剂硫酸铁铵1 mL，显色反应5 min，用分光光度计于451 nm处测定吸光度。该检测方法检出限为2.699μg/mL，精密度RSD（%）值为2.212，加标回收率在93.63%～95.47%之间。结果表明，该方法对鲜牛奶中STC残留的检测效果良好，结果稳定可靠，且每次实验所需时间均在10 min左右，检测成本低廉。适用于各中小企业对自家生产的牛奶进行自我检测，也适用于监管部门对市售牛奶进行快速检测。

通过对目视比色法的不同显色剂、不同指示剂和其它试剂的用法和用量进行对比后最终确定了下述操作步骤：分别准确量取STC标准溶液（质量浓度0.1 g/L）用超纯水配制成质量浓度梯度分别为0，2，5，10，20，50，100μg/mL的STC系列标准溶液。分别从上述7个STC系列标准溶液中取10 mL，置于7只25 mL容量瓶中，编号1～7，分别加入硝酸1 mL酸化，加入数滴结晶紫指示剂，再分别加入显色剂三氯化铁溶液1 mL，反应5 min，用超纯水定容，三组平行操作。选颜色区别最为明显的一组溶液作目视比色法的标准比色卡。然后再取空白牛奶样品和实样牛奶样品以上述方法操作后与标准比色卡对比颜色，确定样品中STC质量浓度区间。此方法操作简单、试剂易得、检测速度快，同样适用于各中小企业对自家生产的牛奶进行自我检测，也适用于监管部门对市售牛奶进行快速检测。