秦凯悦， 赵瑞宁， 李亚杰， 杨博雅， 李佳鑫， 郭凤英， 李光华， 聂黎虹

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院泌尿外科，银川 750004）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性随年龄增长不可避免的进展性疾病[1]，严重时可导致下尿路梗阻症状（lower urinary tract symptoms，LUTS）[2]。雄激素的存在是BPH 发生的前提和基础，但机制仍待进一步明确[3-4]。自噬是广泛存在于真核生物细胞中的一种生命现象[5-6]，其在增生、炎症、衰老等病理生理过程中发挥重要作用[7-8]，雄激素可以调控其发生[9]。研究[10-11]表明，5-α 还原酶抑制剂联合自噬抑制剂可以降低BPH 患者临床进展的危险性，提示细胞自噬水平的改变可能在BPH 进展过程中发挥重要作用。目前关于雄激素调控自噬参与BPH 发生及机制的研究鲜有报道。本研究拟建立雄激素致大鼠BPH 动物模型，采用形态学和分子生物学等实验技术，探讨细胞自噬在雄激素致大鼠BPH 发生中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 SD 大鼠（体质量 250～270 g）购于宁夏医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（宁）2011-001。

1.2 主要试剂

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB-1）（RayBiotech Life 公司，美国）、丙酸睾丸素（testosterone propionate，TP）（北京 Solarbio公司，中国）、氯喹（chloroquine，CQ）（Sigma 公司，美国）、甘草甜素（glycyrrhizin，Gly）（东京化成工业株式会社，日本）、全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物，中国）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物，中国）、5X 蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司，中国）、兔抗LC-3b（Sigma公司，美国）、兔抗 P62（Proteintech 公司，美国）、兔抗 Beclin-1（Proteintech 公司，美国）、兔抗HMGB-1（Abcam 公司，英国）、鼠抗 β-actin（北京中杉金桥公司，中国）、HRP 标记的二抗（北京中杉金桥公司，中国）、ECL 检测试剂盒（江苏凯基生物，中国）、HE 染料（北京中杉金桥公司，中国）、电镜固定液（Servicebio 公司，武汉）、环氧树脂（Sigma 公司，美国）。

1.3 动物模型建立

72 只雄性SD 大鼠随机分为6 组，分别为Control 组、TP 组、HMGB-1 组，TP+HMGB-1 组、TP+CQ 组、TP+Gly 组，每组 12 只。TP 组：大鼠背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］；HMGB-1 组：大鼠麻醉（10%水合氯醛，3 mL·kg-1）后仰卧位固定，取下腹壁正中切口，逐层分离至腹腔，于膀胱下寻找到前列腺，行前列腺多点注射HMGB-1（200 ng），腹腔注射 1 次青霉素钠（20 万单位）预防感染；TP+HMGB-1 组：大鼠前列腺多点注射HMGB-1（200 ng）并行背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］；TP+CQ 组：大鼠背部皮下注射 TP［3 mg·（kg·d）-1］，腹腔注射 CQ［50 mg·（kg·d）-1］；TP+Gly 组：大鼠背部皮下 TP［3 mg·（kg·d）-1］，腹腔注射 Gly［10 mg·（kg·d）-1］；Control 组：大鼠开腹后行前列腺多点注射生理盐水，背部皮下注射橄榄油。

1.4 收集标本与计算前列腺指数

各组大鼠处理21 d 后，在麻醉状态下迅速摘取前列腺组织；随机取4 只，均分两半后用于电镜和HE 染色；8 只测量前列腺体积、湿重用于计算前列腺指数［大鼠前列腺湿重/大鼠体质量×100%］后，组织冻存于-80 ℃冰箱用于Western blot 蛋白检测。

1.5 形态学检测

1.5.1 HE 染色 取前列腺组织在预冷的生理盐水中冲洗干净后，于4%多聚甲醛中固定24 h 取出，置于包埋盒中脱水过夜，次日浸蜡后包埋，冷凝后切片，二甲苯脱蜡，苏木素染色5 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，伊红染色2 min，常规脱水，透明，中性树胶封片，采图。

1.5.2 透射电镜 切取适当大小的前列腺组织在预冷的生理盐水中冲洗干净后放入2%戊二醛4 ℃固定30～40 min，修剪组织呈长方体状，切一角做标记，修剪后的组织取出后放入新的固定液中4 ℃固定2 h，用缓冲液漂洗3 次后置于4 ℃冰箱待用；1%四氧化锇4 ℃染色后磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗 3 次，每次 15 min；于 4 ℃冰箱中丙酮梯度脱水；脱水完成后，室温进行纯丙酮加环氧树脂1∶1 过夜，纯环氧树脂4 h 两次，于包埋板中摆放样品包埋；包埋后树脂固化，超薄切片，柠檬酸铅染色；透射电镜观察。

1.6 Western blot 检测自噬相关蛋白表达情况

准备好蛋白样品，BCA 法蛋白定量后，10%SDS-PAGE 凝胶电泳，切下目的条带后80 V 转膜2 h，5%脱脂牛奶4 ℃冰箱封闭过夜PBST 洗膜，随后加入目的一抗（LC-3b 为 1∶500，P62 为1 ∶2000，Beclin1 为 1 ∶2000，HMGB-1 为 1 ∶1000，β-Actin 为 1∶5000），一抗室温下孵育 2～4 h 后加入目的二抗（2.5%脱脂牛奶配制1∶5000）室温孵育2 h 后，配化学发光液ECL 显色，拍照。

1.7 统计学方法

数据运用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BPH 大鼠不同处理后前列腺体积、湿重以及指数的比较

与Control 组比较，其他各组大鼠前列腺湿重和指数均有所增加（P 均＜0.05）；TP+HMGB-1组各项指标均高于TP 组，HMGB-1 组、TP+CQ组和 TP+Gly 组各指标均低于 TP 组（P 均＜0.05）；HMGB-1、TP+CQ 和 TP+Gly 组各指标之间差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表 1。

2.2 BPH 大鼠不同处理后前列腺组织HE 染色结果

Control 组大鼠前列腺腺体排列整齐，管腔大小较均匀，腺上皮细胞绝大多数呈单层柱状、基底膜较完整，间质细胞未见增生及炎细胞浸润；TP 组前列腺腺体大小不一，多数腺体区域腺上皮呈多层高柱状增生、部分呈乳头样增生，部分间质细胞也出现增生，可见炎细胞浸润；HMGB-1 组前列腺腺体大小基本一致，腺上皮多层高柱状增生；TP+HMGB-1 组腺体增生更加明显，多数呈复层乳头状增生，细胞间质纤维结缔组织增生明显伴大量炎性细胞浸润，间质区域血管扩张充血明显；TP+CQ 组和TP+Gly 组较TP 组前列腺上皮增生情况明显缓解，部分腺上皮细胞呈复层高柱状增生，仅见少量炎细胞浸润，见图1。

表 1 BPH 大鼠不同处理后体质量、前列腺体积、湿重及指数的比较（）

表 1 BPH 大鼠不同处理后体质量、前列腺体积、湿重及指数的比较（）

与 Control 组比较 *P＜0.05，**P＜0.01；与 TP 组比较 #P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n 体质量/g 前列腺体积/mL 前列腺湿重/g 前列腺指数Control 组 8 359±16 0.46±0.09 0.55±0.08 1.53±0.25 TP 组 8 349±8 1.16±0.21** 1.11±0.03** 3.18±0.12**HMGB-1 组 8 372±29 0.80±0.11*# 0.72±0.06*## 2.01±0.22*##TP+HMGB-1 组 8 328±15 1.66±0.49**# 1.26±0.17**# 3.74±0.40**#TP+CQ 组 8 312±19 0.73±0.05# 0.71±0.12*## 2.28±0.31*##TP+Gly 组 8 326±14 0.74±0.15# 0.74±0.13*## 2.23±0.39*##

2.3 透射电镜观察不同处理的BPH 大鼠前列腺组织自噬小体形成情况

Control 组前列腺上皮细胞内很少见到自噬小体；TP 组和HMGB-1 组细胞内有较多自噬小体，且有疑似自噬小体的结构；TP+HMGB-1 组较TP 组和HMGB-1 组可见更多的自噬小体；TP+CQ 和TP+Gly 组仍可见到自噬小体，见图2。

2.4 BPH 大鼠不同处理后前列腺组织自噬相关蛋白的表达

与 Control 组比较，TP、HMGB-1 和 TP+HMGB-1 组前列腺组织 LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1、Beclin-1蛋白表达水平均上调，P62 蛋白表达下调（P 均＜0.05），TP+HMGB-1 组较 TP 和 HMGB-1 组 LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1 蛋白表达水平均上调（P 均＜0.05）；TP 组与HMGB-1 组相比各指标之间差异无统计学意义（P 均＞0.05）；与 TP 组、HMGB-1组和TP+HMGB-1 组相比，TP+CQ 组和 TP+Gly组LC-3bⅡ/Ⅰ、HMGB-1 蛋白表达水平均下调，P62 蛋白表达上调（P 均＜0.05），见图 3。

3 讨论

图 1 BPH 大鼠不同处理后前列腺组织HE 染色结果（×200）

图 2 不同处理的BPH 大鼠前列腺组织透射电镜结果（×25000）

图3 BPH 大鼠不同处理后前列腺组织自噬相关蛋白的表达结果

BPH 是引起中老年男性排尿障碍原因中最常见的一种疾病[12]，通常发生在40 岁以后，50 岁男性的发病率约为40%，80 岁时高达80%，严重影响了中老年男性健康[13]。前列腺是终生依赖雄激素的器官，体内睾酮经5-α 还原酶作用，在前列腺间质部位转化为双氢睾酮，通过旁分泌的形式，与前列腺细胞的雄激素受体（androgen receptor，AR）结合，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡从而促BPH 发生[11]。作为BPH 最主要的治疗药物，5-α 还原酶抑制剂起效缓慢，提示雄激素促BPH 发生的机制仍待进一步明确。近年来，自噬信号通路的激活在BPH 进展中的作用备受关注[14]。雄激素参与细胞自噬水平的调控，AR 可通过转录调控自噬核心基因和溶酶体基因上调自噬水平促前列腺癌的发展[15]。本课题组前期研究[16]表明，HMGB-1 参与了 BPH 的发生。BPH 患者前列腺组织中HMGB-1 的表达水平与其前列腺体积呈正相关；HMGB-1 可通过多种途径调控细胞自噬的发生[17-18]。以上现象提示，雄激素可能通过激活自噬促BPH 的发生，HMGB-1 可能参与了雄激素介导前列腺细胞自噬水平的变化。

本研究首先建立雄激素致大鼠BPH 动物模型。实验观察到TP 组大鼠前列腺组织明显增生、自噬关键蛋白表达及自噬小体数量增加；联合给予自噬抑制剂（TP+CQ）可致前列腺细胞自噬水平下调、组织增生程度减轻，提示雄激素可能通过激活细胞自噬促前列腺组织增生的发生。实验同时观察到，TP 组大鼠前列腺组织HMGB-1 表达水平增加、炎细胞浸润；HMGB-1 是晚期炎症因子，也是重要的自噬调控因子，提示表达增多的HMGB-1 可能参与了雄激素促前列腺细胞自噬水平上调的过程。为了验证HMGB-1 在雄激素介导细胞自噬致大鼠前列腺增生中的作用，本研究首先给予大鼠前列腺多点注射HMGB-1，同样观察到前列腺组织增生、细胞自噬水平增加；其次，联合给予TP+HMGB-1 致大鼠前列腺组织进一步增生、细胞自噬水平进一步增加；最后，联合给予HMGB-1 抑制剂（TP+Gly），观察到与TP+CQ 组类似的抑制细胞自噬及组织增生的实验结果，提示TP 通过HMGB-1 介导前列腺细胞自噬、促组织增生的发生，而两者可能具有协同促前列腺细胞自噬及组织增生的作用。

综上所述，雄激素可以通过上调HMGB-1促细胞自噬致大鼠前列腺组织增生。在大鼠BPH发生的过程中，雄激素如何上调HMGB-1 及其二者如何协同发挥促前列腺组织增生的作用等均有待进一步探讨。