杨 红 ， 贾 伟 ， 康 佳 ， 周云花 ， 杨宁爱 ， 康宇婷 ， 苏雅静 ，乔 霞 ， 汪澎涛 ， 赵志军

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学临床病原微生物重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）

急性髓系白血病是成人最常见的急性白血病[1]，属于造血系统恶性肿瘤。黄芪甲苷是从中药黄芪中提取出来的一种高纯度药物，具有增强机体免疫力、改善心肺功能、提高机体抗病能力等作用[2-3]。近年来，有研究[4-9]报道，黄芪甲苷对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤侵袭和迁移等作用。黄芪甲苷对急性髓系白血病HL60 细胞的作用尚不清楚，因此本研究以急性髓系白血病HL60 细胞为模型，观察黄芪甲苷对其增殖和凋亡的影响，以期为临床用黄芪甲苷治疗急性髓系白血病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人急性髓系白血病HL60 细胞，购买于上海名劲生物科技有限公司，起始来源ATCC，已进行STR 鉴定。黄芪甲苷购买于成都普瑞法生物科技有限公司（批号：84687-43-4，HPLC：98%，规格：250 mg），避光保存。配制方法：实验前将黄芪甲苷溶于 DMSO 中，使其浓度为 25 mmol·L-1，临用时用含血清培养液稀释至实验所需浓度，使DMSO 浓度＜0.1%。IMDM 基础培养液购于上海BasalMedia 公司；胎牛血清购于以色列BI 公司；青链霉素混合液购于北京索莱宝公司；Trizol购于美国Ambion 公司；反转录试剂盒（批号：RR036A）和 Real-Time PCR 试剂盒（批号：RR820）购于日本TaKaRa 公司；BCA 蛋白含量检测试剂盒、全蛋白检测试剂盒和SDS-PAGE 快速凝胶配制试剂盒购于凯基生物公司；CCK-8 细胞增殖检测试剂盒购于北京全式金生物公司；Annexin Ⅴ-APC/7-AAD 凋亡试剂盒（批号：AP105-60）购于联科生物公司，Hochest 33258 染色液（批号：C1018）购于上海碧云天生物技术有限公司。兔抗Bax（批号：A7626）、兔抗 Bcl-2（批号：A19693）和山羊抗兔IgG 二抗（批号：AS014）均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；β-actin 一抗（批号：bs-0061R）购自北京博奥森生物技术有限公司；Real Time PCR 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的HL60 细胞于37 ℃水浴迅速解冻，接种于含20% FBS 和1%青链霉素混合液的IMDM 培养液中，置于细胞培养箱中培养，每2 d 更换1 次培养液，待细胞密度增高时传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 CCK-8 实验检测细胞增殖情况 取对数生长期 HL60 细胞，按 6×104个/mL 细胞密度接种于含不同浓度黄芪甲苷（5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1）的 96 孔板中，每孔 100 μL，同时设定空白对照组（只含100 μL 完全培养液）和溶剂对照组（溶剂浓度与最大浓度药物组所含溶剂浓度一致），接种后 48 h 加入 10 μL CCK-8 试剂，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测波长450 nm 处吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=［（A对照孔-A实验孔）（/A对照孔-A空白孔）］×100%。每组设3 个复孔，实验重复3 次。

1.2.3 台盼蓝染色计数法绘制细胞生长曲线 取对数生长期 HL60 细胞，按 2×105个/mL 密度接种于含不同浓度黄芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的24 孔板中，每孔1 mL，同时设定溶剂对照组（同1.2.2 项），每组设21 个复孔，每天从各组取3 孔细胞进行台盼蓝染色计数，连续7 d，绘制HL60 细胞生长曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取对数生长期 HL60 细胞，按 1×105个/mL 细胞密度接种于含不同浓度黄芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的6 孔板中，每孔2.5 mL，同时设定溶剂对照组（同 1.2.2 项），每组设 3 个复孔，培养 72 h 后，离心收集细胞，预冷 PBS 清洗 2 遍，加入 500 μL 结合缓冲液重悬细胞后加入5 μL Annexin Ⅴ-APC和10 μL 7-AAD 轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15 min 后上机检测。

1.2.5 Hochest 33258 染色实验检测细胞凋亡形态变化 取对数生长期 HL60 细胞，按 2×105个/mL 密度接种于含不同浓度黄芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 24 孔板中，每孔 1 mL，同时设定溶剂对照组（同1.2.2 项），培养72 h后离心收集细胞，用固定液固定后滴加至载玻片，加入0.5 mL Hochest 332558 染色液避光染色5 min，置于荧光显微镜下观察细胞凋亡形态变化。

1.2.6 Real Time PCR 检测细胞 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表达情况 取对数生长期HL60 细胞，按1×105个/mL 细胞密度接种于含不同浓度黄芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 6 孔板中，每孔2.5 mL，同时设定溶剂对照组（同1.2.2 项），培养72 h 后离心收集细胞，加入Trizol 试剂抽提RNA，按照TaKaRa 反转录试剂盒操作合成cDNA，按照TB Green®Premix Ex TaqTMII 操作说明进行Real Time PCR 实验。反应体系：上游引物、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Master Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，总体积 20 μL。反应条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，70 ℃延伸30 s，共40 个循环；65 ℃彻底延伸1 min。Bax 上游引物：5′-ATCAGAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游引物：5′-AGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGA-3′；Bcl-2 上游引物：5′-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTG-3′，下游引物：5′-ACTCACATCACCAAGTGCACCTAC-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。实验以 GAPDH 为内参，以 2-ΔΔct计算 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表达量。

1.2.7 Western blot 检测细胞 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达情况 细胞培养、分组同1.2.4 项，培养72 h后，离心收集细胞，用全蛋白提取试剂盒提取各组细胞蛋白后按照Western blot 实验说明进行电泳、转膜、封闭、一抗（兔抗Bax 和兔抗Bcl-2 以1∶1000 比例稀释，β-actin 一抗以 1∶20000 比例稀释）孵育、二抗（山羊抗兔 IgG 二抗以 1∶10000 比例稀释）孵育及曝光等步骤，结果用Image J 2.0进行灰度扫描及分析。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对HL60 细胞增殖的影响

CCK-8 结果显示，经黄芪甲苷干预48 h 后，与对照组相比，当黄芪甲苷浓度≤40 μmol·L-1时，黄芪甲苷对HL60 细胞存活率无影响；当黄芪甲苷浓度>40 μmol·L-1时，HL60 细胞存活率出现降低趋势，160 μmol·L-1和 320 μmol·L-1时最为明显（P 均＜0.01），见图 1。因此，后续实验选择的黄芪甲苷浓度为 10、20、40、80 μmol·L-1。

图1 黄芪甲苷对HL60 细胞存活率的影响

2.2 黄芪甲苷对HL60 细胞生长曲线的影响

连续7 d 台盼蓝染色计数法结果显示，与对照组相比，随着黄芪甲苷浓度升高，HL60 细胞增殖能力越弱。培养细胞至第7 天时，溶剂对照组细胞增殖倍数达11.207；含黄芪甲苷终浓度为80 μmol·L-1的实验组细胞增殖倍数仅为 0.310，见图2。

图2 黄芪甲苷对HL60 细胞生长曲线的影响

2.3 黄芪甲苷对HL60 细胞凋亡的影响

Hochest 33258 染色结果显示，与对照组相比，HL60 细胞经不同浓度黄芪甲苷干预后，出现不同程度细胞核固缩、核碎裂，80 μmol·L-1黄芪甲苷干预细胞组最明显，结果见图3A。流式细胞术结果显示，与对照组相比，HL60 细胞凋亡比率随着黄芪甲苷浓度的升高而增高（P＜0.01），见图3B、图 C。

图3 黄芪甲苷对HL60 细胞凋亡的影响

2.4 黄芪甲苷对HL60 细胞Bax 及Bcl-2 mRNA表达水平的影响

Real Time PCR 结果显示，与对照组相比，HL60 细胞经含 10、20、40、80 μmol·L-1黄芪甲苷浓度培养液培养72 h 后，Bax mRNA 表达水平随黄芪甲苷浓度升高而增高，Bcl-2 mRNA 表达水平随黄芪甲苷浓度升高而降低（P 均＜0.05），见图4。

2.5 黄芪甲苷对HL60 细胞Bax 及 Bcl-2 蛋白表达水平的影响

Western blot 结果显示，与对照组相比，随着黄芪甲苷药物浓度的升高，Bax 的蛋白表达量上调，Bcl-2 的蛋白表达量下调（P 均＜0.01），见图5。

3 讨论

近年来，由于中医药具有标本兼治、毒副作用小等优点逐渐被各研究者重视，中药黄芪具有补气、止汗、利尿消肿、排脓等功效，被广泛应用于急性肾炎、高血压、糖尿病、缺血性心脏病等疾病的治疗[10]。黄芪甲苷是中药黄芪的有效成分之一，被认为是黄芪质量的判断标准[11]。黄芪甲苷可通过 PI3K/Akt 信号通路[12-13]、JNK/Nrf2 信号通路[14]、Wnt/β-catenin 信号通路[15]、Nrf2/HO-1 信号通路[16]等多个作用位点抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡或降低其侵袭力和迁移力等。

本研究结果显示，经 10、20、40、80 μmol·L-1浓度黄芪甲苷干预72 h 后，HL60 细胞存活率下降，细胞凋亡比率逐渐升高，出现细胞核固缩等典型凋亡形态变化，细胞凋亡基因Bax 和Bcl-2转录水平和蛋白水平表达均发生了相应变化，表明黄芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 细胞增殖，诱导其凋亡。有研究[17]通过MTT 实验方法发现，黄芪甲苷对HL60 细胞增殖无明显抑制作，分析原因可能与其实验药物来源、浓度、干预时间、实验方法等均与本文不同有关，其中药物干预时间不同的影响可能最大，本文中Real Time PCR 和Western blot 实验药物干预时间均为72 h，药物作用时间更长。

图 4 Real time PCR 检测Bax 及Bcl-2 mRNA 表达情况变化

图5 Western blot 检测凋亡比较相关因子蛋白表达变化情况

外界环境和遗传因素等原因均可引起DNA损害，从而导致肿瘤的发生，其本质是基因病，涉及原癌基因、抑癌基因、DNA 修复基因、细胞凋亡等相关基因的改变，其中，细胞凋亡是通过细胞的主动有序死亡使机体中细胞数量保持基本恒定的正常生理过程，Bax 和Bcl-2 是目前细胞凋亡研究中功能对立的最重要一对细胞凋亡因子，二者的比率决定细胞凋亡过程是否启动[18]。有研究[19]表明，黄芪甲苷作用后可明显促进Bax的表达，抑制Bcl-2 的表达，提高肝癌细胞HepG 2 凋亡率，与本实验结果一致。但黄芪甲苷诱导HL60 细胞凋亡的具体作用及机制仍需通过体内实验等进行深入探究。

综上，在体外黄芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 细胞增殖，诱导其凋亡，这可能与调节Bax/Bcl-2 凋亡信号通路有关。