方丹丹， 杨 华， 李 元， 路玉祥， 李西艳， 杨 丽， 楚元奎

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学实验动物中心，银川 750004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全世界男性患者最常见的恶性肿瘤，在男性肿瘤患者中的发病率和病死率中分别位于第2 位和第4 位[1]。2015 年我国PCa 新发病例数约为60300 例，死亡人数约为26600 例，新发病例数和死亡人数均排在男性泌尿系统肿瘤的第2 位[2]。尽管早期PCa 经过局部手术可达到较好的治疗效果，但部分患者随着病情进展需采用雄激素剥夺疗法。经过18～24 个月雄激素剥夺法治疗后，PCa 最终发展为雄激素非依赖性PCa，这类患者治疗及预后均较差，临床上尚无有效的治疗方法[3]。因此，进一步揭示PCa 发生、发展的分子机制，将有助于提高其临床诊断和治疗水平。

微小 RNA（microRNAs，miRNAs）是一类高保守内源性单链小分子非编码RNA，长度约为18～25 个核苷酸，可通过与靶基因序列互补结合，从转录后水平抑制靶基因的表达，是基因调控网络中的核心成分。多种miRNAs 参与了PCa 的发生、发展，在PCa 细胞的增殖和转移过程中发挥着重要的作用[4-8]。已有研究[9-11]表明，miR-3064-5p 在肝癌和胃癌细胞生长调控中发挥抑癌作用。目前miR-3064-5p 在PCa 细胞增殖与转移中的作用仍不明确。本研究旨在进一步阐明miR-3064-5p 在PCa 细胞增殖与转移中的作用并探讨其分子机制，以期为PCa 的诊断和治疗寻找新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人PCa 细胞株PC3、DU145、正常前列腺上皮细胞RWPE-1 及K-SFM 培养液购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（中国上海）。胎牛血清和RPMI-1640 培养基购自GIBCO 公司；mimic nc 及 miR-3064-5p mimic、靶向真核翻译起始因子5（EIF5）双荧光素酶报告载体由广州锐博生物科技有限公司合成；转染试剂Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司；Trizol试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；HiS-cript II Q RT SuperMix for qPCR 和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 购自诺唯赞公司；兔抗人EIF5抗体、鼠抗人GAPDH 抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗购自美国ProteinTech-Group 公司；总蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Dual-GloRLuciferase Assay System试剂盒购自美国Promega 公司；miR-3064-5p 序列来源于NCBI 网站，检测引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 PC3 和DU145 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，RWPE-1 细胞培养于K-SFM 培养液，培养条件为37 ℃、5%CO2的恒温、恒湿环境。选取对数期生长的PC3 细胞以相应密度接种于60 mm 培养皿和6 孔板中，待细胞培养24 h 贴壁后按照Lipofectamine 2000 试剂操作说明书进行转染，将PC3细胞分为转染mimic nc 组及miR-3064-5p mimic 组，48 h 后收集细胞用于后续检测。

1.2.2 qRT-PCR 检测 Trizol 法提取各实验组细胞总RNA 并测定其浓度。按照HiScriptIIQRTSuperMix for qPCR 和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书对上述RNA 进行反转录和PCR 检测。miR-3064-5p 反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACG-3′；miR-3064-5p 上游引物：5′-TGTGGCTGTTGTGGTGTGC-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；EIF5 上游引物：5′-GTTCTATCGCTACAAGATGCCC-3′，下游引物：5′-CTCCCAGCTCACAACCAAAA-3′；GAPDH上游引物：5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物：5′-ATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，58 ℃ 25 s，70 ℃25 s，36 个循环；72 ℃10 min。实验重复 3次，2-ΔΔCt法计算 miR-3064-5p 和 EIF5 的相对表达量，小核RNA U6（U6）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）分别作为内参。

1.2.3 细胞克隆形成实验 取对数生长期的PC3 细胞，0.25%胰酶消化后，以 600 个细胞/孔的密度接种于12 孔板中，细胞继续培养24 h 贴壁后，Lipofectamine 2000 法转染 mimic nc 及miR-3064-5p mimic。细胞继续培养 10～14 d，每隔3 d换1 次液。PBS 清洗细胞3 次，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色 3～4 min，PBS 清洗 3 次，干燥后计数细胞克隆数，并计算克隆形成率。

1.2.4 MTT 实验 将对数生长期细胞接种于4个96 孔板中，每组6 个复孔，待细胞贴壁后转染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic，分别于转染后24、48、72 和 96 h、每孔加入 30 μL MTT 试剂，37 ℃放置 4 h，弃掉培养液，加入 150 μL 二甲基亚砜，在酶标仪490 nm 处测各孔光密度（OD）值。

1.2.5 划痕愈合实验 取对数生长期的PC3 细胞，0.25%胰酶消化后，以2×105个细胞/孔的密度接种于6 孔板中培养。细胞培养24 h 后转染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic，使用 200 μL 黄色枪头各孔平行划3 条线。随后，PBS 清洗3 次，加入RPMI-1640 培养液继续培养。100×光镜下于指定时间在指定位置对各孔进行拍照，测量各组划痕宽度后进行统计学分析。

1.2.6 Transwell 实验 细胞分组转染mimic nc及miR-3064-5p mimic 后，消化接种于Transwell小室中，每个小室 5×104个细胞，培养 24 h 后PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，PBS 清洗2 次后用棉签擦净小室膜上方细胞，干燥后400×光镜下随机选取5 个视野拍照并计数进行分析。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 构建分别含EIF53’-UTR 野生型（EIF5-WT）和突变型（EIF5-Mut）序列的双荧光素酶报告载体（广州锐博生物科技有限公司）。选取对数期生长的293T 细胞以1.5×104/孔的密度接种于 96 孔板中，培养24 h 细胞贴壁后，脂质体法将构建的野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别与mimic nc 及miR-3064-5p mimic 共转染入293T 细胞。细胞继续培养48 h后，使用 Promega 公司的 Dual-Glo®Luciferase Assay System 试剂盒检测各组细胞的双荧光素酶基因活性，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.2.8 Western blot 检测 分别收取转染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic 培养 72 h 后的 PC3 细胞，Western blot 法检测 EIF5 和 GAPDH 的表达。蛋白裂解液RIPA 提取各组细胞总蛋白，BCA 法检测其浓度并计算上样量，随后进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶70 V 电泳60 min，分离胶100 V 电泳 60 min，湿转法转至 PVDF 膜，300 mA 115 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入适当浓度的一抗4 ℃孵育过夜，PBST 清洗3 遍后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。PBS 漂洗后ECL化学发光试剂显影。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 19.0 和 Graph Pad Prism 8.0 统计软件对数据进行分析。实验重复3 次，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-3064-5p 在PCa 细胞中低表达

miR-3064-5p 在 PCa 细胞系 PC3、DU145 中的表达水平低于正常前列腺上皮RWPE-1 细胞（P 均＜0.01），见图 1A。miR-3064-5p 的表达在 PC3和DU145 细胞中差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。本研究选择PC3 细胞作为后续研究对象。将PC3细胞分组转染mimic nc 及miR-3064-5p mimic，miR-3064-5p mimic 组 miR-3064-5p 的表达水平较 mimic nc 组升高（P＜0.001），见图 1B。

2.2 miR-3064-5p 抑制PC3 细胞的增殖

细胞克隆形成实验结果显示，与mimic nc 组相比，miR-3064-5p mimic 组细胞克隆形成数量减少（图 2A）。MTT 实验结果显示，mimic nc 组PC3 细胞生长变缓，在 96 h 时 miR-3064-5p mimic 组与mimic nc 组OD 值差异有统计学意义（P＜0.01），见图 2B。

2.3 miR-3064-5p 抑制PC3 细胞的迁移和侵袭

划痕及Transwell 实验结果显示，与mimic nc组相比，miR-3064-5p mimic 组细胞的迁移侵袭能力降低（P 均＜0.05），见图 3。

2.4 miR-3064-5p 靶向作用于EIF5 基因

图1 miR-3064-5p 的相对表达水平

图2 miR-3064-5p 对PC3 细胞增殖能力的影响

图3 miR-3064-5p 对PC3 细胞迁移侵袭能力的影响

使用Starbase 在线预测miR-3064-5p 潜在靶基因，结果显示，EIF5 可能是miR-3064-5p的一个下游靶标。构建EIF5-WT 和EIF5-Mut 双荧光素酶报告载体，将两者分别与mimic nc 及miR-3064-5p mimic 共转染入PC3 细胞。共转染miR-3064-5p mimic 和EIF5-WT 组荧光素酶活性较共转染 mimic nc 与 EIF5-WT 组降低（P＜0.05），而共转染 miR-3064-5p mimic 和 EIF5-Mut组的荧光素酶活性与共转染mimic nc 和EIF5-Mut 组差异无统计学意义（P>0.05），见图 4A。miR-3064-5p 高表达后，EIF5 在 mRNA 水平和蛋白水平表达均降低（图4B、图4C）。

图4 miR-3064-5p 与EIF5 靶向关系验证

3 讨论

miRNAs 广泛参与了肿瘤发生、发展的生物过程[7-11]，目前关于miR-3064-5p 在肿瘤发生、发展调控中的作用报道较少。Zhang 等[9]报道，miR-3064-5p 在肝癌组织与细胞系中表达降低，miR-3064-5p 的过表达可通过靶向调节FOXA1/CD24/Src 通路有效抑制肝癌细胞的增殖并控制血管生成和肿瘤转移。Wang 和 Sun 等[10-11]发现，在胃癌中miR-3064-5p 通过调控下游靶基因PTPN14、COL6A3 的表达起到抑癌作用。而miR-3064-5p 在PCa 细胞中的表达水平和生物学功能尚不清楚。本研究发现，miR-3064-5p 在PCa 细胞PC3 和DU145 中的表达低于正常前列腺上皮细胞，进一步功能实验验证，过表达miR-3064-5p可抑制PC3 细胞的增殖和转移能力，表明miR-3064-5p 在PC3 细胞生长调控中发挥抑癌作用。

miRNAs 可通过与靶基因序列互补结合，从转录后水平调控靶基因的表达。为进一步明确miR-3064-5p 抑制PCa 细胞增殖和迁移的分子机制，通过Starbase 生信分析miR-3064-5p 下游靶点，显示EIF5 为miR-3064-5p 潜在靶基因。EIF5 属于真核翻译起始因子（EIFs）家族，该家族成员通过互相配合调控mRNA 翻译的启动，从而影响真核基因表达。现已发现的EIFs 有EIF1、EIF1a、EIF2、EIF2b、EIF3、EIF4a、EIF4e、EIF4g、EIF4b、EIF4h、EIF5 和 EIF5b[12]。EIFs 的失调会导致多种疾病。许多肿瘤中EIFs 复合物的活性都显示异常，EIFs 的表达异常进而使肿瘤相关蛋白的mRNA 发生选择性翻译[13]。本研究关注的目标基因EIF5 可通过与40S 起始复合物相互作用，并伴随着60S 核糖体亚基与40S 起始复合物的结合，促进结合的鸟嘌呤三核苷酸磷酸水解。所得的功能性80S 核糖体起始复合物随后在肽基转移和链延长中具有活性[14]。Song 等[15]研究发现，在肾透明细胞癌中，miR-107 靶向结合EIF5抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。Huang 等[16]发现，circRNA-100338 通过激活mTOR 信号通路促进EIF5 的表达，进而促进肝细胞癌发生转移。上述研究表明，EIF5 在多种癌症中发挥促癌作用。本研究通过双荧光素酶报告实验、qRT-PCR 和Western blot 检测证实 miR-3064-5p 与 EIF5 基因间存在靶向结合位点，同时也证明了miR-3064-5p 在PC3 细胞增殖和转移调控中发挥抑制作用，这种抑制作用可能是通过下调EIF5 基因的表达实现。

综上所述，miR-3064-5p 在PCa 细胞中低表达，过表达miR-3064-5p 可能通过下调EIF5 的表达抑制PC3 细胞的增殖和转移，上述结果可为PCa 的诊断和治疗提供新的思路。