伍 姿 黄冬梅 娄晓祎 孔 聪 张 璇 方长玲 叶洪丽

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海200090；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

动物源性食品是指全部可食用的动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品（含动物脏器）、水生动物产品等。随着我国居民生活水平的日益提高，动物源性食品已成为国民饮食结构的主要成分[1]。但动物源性食品目前存在着一些安全隐患，主要包括药物残留（兽药残留和农药残留）、重金属超标、劣质动物疫苗以及环境污染等。近年来，为了防治各种动物疫病、缩短动物饲养周期、降低动物死亡率，从而提高动物源性食品的产量，存在不合理甚至非法使用药物，导致动物源性食品中药物残留超标的问题[2]。尤其是兽药，在水产和畜牧业中的使用较多，这些药物可经食物链传递危及人类健康，因此动物源性食品中兽药残留问题备受关注[3]。

氨苯砜（4，4"－diaminodiphenylsulfone，DDS）作为一种禁用的兽药，使用后不能完全代谢分解，可能残留于动物体内，从而导致动物源性食品中存在一定的氨苯砜及其代谢物残留。然而现阶段对氨苯砜及其代谢物残留量检测的研究和报道并不多，因此必须加强对动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留的检测和监控。本文概述了氨苯砜及其代谢产物的作用机制、危害和法规标准，系统地综述了动物源性食品中氨苯砜及其主要代谢产物N－乙酰氨苯砜的前处理方法和检测方法，同时对其分析方法进行了展望，旨在为动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留量的检测和监控提供参考。

一、氨苯砜及其代谢产物的作用机制

氨苯砜是一种苯胺衍生物，在1908年首次合成，属于合成砜类，呈黄白色无臭结晶性粉末，分子式为C12H12N2O2S，包含一个硫原子连接两个碳原子的结构。DDS性质稳定，可燃，和强氧化剂不相溶，代谢产物为N－乙酰氨苯砜（N－acetyl dapsone，MADDS）和羟胺氨苯砜（DDS－NOH）。口服给药后，DDS几乎完全被肠道吸收，生物利用率超过86%[4]。DDS由肠道吸收后经过肝肠循环由肝脏代谢，也由活化的多形核白细胞（PMN）和单核细胞代谢。在肝脏中，氨苯砜主要通过N－乙酰基转移酶的乙酰化作用，代谢为N－乙酰氨苯砜，并通过细胞色素p－450羟化酶的羟基化作用，产生羟胺氨苯砜[5]。

研究发现，氨苯砜具有一定的药物经济效益，与磺胺类药物具有协同增效作用，常作为磺胺增效剂在动物和水产养殖中使用。DDS及其代谢产物的化学结构中具有磺酰基，是发挥药效的主要基团，DDS及其代谢产物具有抗菌、抗炎的作用[6～7]。其抗菌作用主要是通过与对氨基苯甲酸（PABA）竞争二氢喋啶合成酶活性位点，从而抑制细菌中的二氢叶酸合成酶（DHPS），干扰叶酸合成，进而影响细菌的生长繁殖[6]；抗炎作用主要是通过影响中性粒细胞或嗜酸性粒细胞，使其在应激状态下产生具有清除作用的氧自由基等物质，减少炎症介质的释放，从而作为抗炎药用于治疗以中性粒细胞或嗜酸性粒细胞积聚和活化为特征的慢性炎症性皮肤病，减少对机体的损伤[7～8]。

二、氨苯砜及其代谢产物残留的危害及法规标准

（一）氨苯砜及其代谢产物残留的危害在动物养殖过程中，氨苯砜及其代谢产物可以抑制多种致病菌的生长，如麻风杆菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌等，对于某些皮肤病和传染病有着明显的治疗作用，但氨苯砜会经过食物链富集传递危及人类健康[7，9]。研究表明，氨苯砜药物经机体吸收后广泛分布于体内，与其代谢产物能够保留在皮肤和肌肉，尤其是肝脏和肾脏中[9]。该药物还能分散到汗液、唾液、眼泪和胆汁中，甚至可以穿过血脑屏障和胎盘，进入母乳。50%～90%的DDS可与血浆蛋白结合，而MADDS几乎完全与血浆蛋白结合，存在明显的毒副作用[5]。最显著的副作用是与剂量相关的溶血（可能导致溶血性贫血）和高铁血红蛋白血症，甚至造成罕见的再生障碍性贫血，还可能对肝肾功能和神经系统造成损害[4,10]。

（二）国内外相关法规及标准关于动物源性食品中氨苯砜及其主要代谢产物N－乙酰氨苯砜残留的问题已引起了国际组织以及许多国家和地区的高度重视。根据欧洲委员会指令，DDS已被禁止用于生产食品的动物，欧盟2377／90、37／2010公告也明确规定DDS是禁用兽药。我国农业农村部第250号公告发布的 《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中规定DDS禁止使用于所有的食品动物[11]；GB/T 29706－2013《食品安全国家标准动物性食品中氨苯砜残留量的测定 液相色谱－串联质谱法》规定，动物性食品中DDS残留量的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.5μg/kg[12]；出入境检验检疫行业标准SN/T 2219－2008《进出口动物源性食品中氨苯砜及其代谢产物残留量检测方法液相色谱－质谱/质谱法》规定，进出口动物源性食品中DDS及其代谢产物残留量的检出限为0.5 μg/kg[13]；国家标准GB/T 22940－2008《蜂蜜中氨苯砜残留量的测定 液相色谱－串联质谱法》规定蜂蜜中DDS残留量的检出限为2.0μg/kg[14]。

三、氨苯砜及其代谢产物的样品前处理方法

对于氨苯砜及其主要代谢产物N－乙酰氨苯砜残留的检测，其样品前处理过程主要有提取、净化、浓缩等步骤，常用的提取试剂、净化材料和浓缩方法见表1。其中净化过程复杂，方法灵活多样，所以这一步骤非常关键，也是研究的重点，需要根据不同样品基质和检测要求选择正确的净化方法。目前在动物源性食品中，有关提取氨苯砜及其代谢产物N－乙酰氨苯砜最常用的样品前处理净化方法包括液－液萃取法（liquid－liquid extraction，LLE）、 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）、分子印迹技术（molecular imprinting，MI）等。

表1 氨苯砜样品前处理提取试剂、净化材料和浓缩方法

（一）液－液萃取法液－液萃取法作为一种经典的净化方法，通常采用漏斗振荡或涡旋萃取两种方式，利用待测组分在不相混溶的两种溶剂中溶解性的差异从而达到净化的目的。对于氨苯砜残留的检测常使用甲醇和乙腈等有机溶剂进行萃取，该法可一次用于多个样品的萃取，从而将被测组分从大量内源性物质中分离出来，并减少杂质对测定的干扰。彭涛等[15]在聚丙烯离心管中用酸化乙腈萃取鸡肉组织中的氨苯砜，然后涡旋、振荡、离心后收集上清液，操作简单、经济实用；岑海蓉等[16]用体积比为80%的乙腈水溶液提取猪肉样品组织中的氨苯砜和N－乙酰氨苯砜，再经涡旋、超声等液液萃取法进行处理，最后可将萃取液蒸发，使组分富集。液－液萃取法虽然对实验条件和仪器要求不高，但该方法的净化效果相对较差、操作费时、有机溶剂消耗大。

（二）固相萃取法固相萃取法是基于色谱分离最常用的样品前处理净化方法，将待测物质从不同样品中分离后，经过不同类型的固相萃取柱，利用选择性吸附和选择性洗脱的分离原理进行样品净化。该法既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取，又可用于净化、浓缩和富集。目前，已有多种SPE柱被用于氨苯砜样品的净化，如C18柱、HLB柱、MCX柱等，对于分离纯化动物源性食品中的氨苯砜及其代谢产物均有一定效果。田云等[17]在检测动物组织样品中的氨苯砜及N－乙酰氨苯砜残留的过程中，用HLB和MCX固相萃取柱依次净化，浓缩后检测得到定量下限为0.5μg/kg，回收率为92%～103%，结果能够达到国际标准；岑海蓉等[16]采用新型Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行净化，处理过程简单、省时且回收率高；孙晓娟等[18]用HLB固相萃取柱萃取净化，经40%的甲醇溶液淋洗，检测得到的结果回收率高，为90.0%～110.0%，检出限为0.1μg/kg。

（三）分子印迹技术分子印迹技术（molecularly imprinted technique，MIT）是一种高选择、高专一性的分离技术。分子印迹聚合物（MIP）是一种新型的分子识别材料，这种材料具有高度的专一性和稳定性，其识别机制与抗体－抗原反应类似，能够用于物质的特异性吸附[19]。MIP制备简单，能反复使用，机械强度高，稳定性好，适用于作为SPE的填充剂或分子印迹薄膜，从而分离富集复杂基质中的痕量分析物，已被广泛应用于兽药残留的分析。卢福广等[20]通过制备氨苯砜分子印迹化学发光传感器检测动物源性食品和药物中氨苯砜的含量，该法不仅节省溶剂，还能够很好地减少复杂基质和杂质的干扰，分析也更简便，比传统固相萃取法具有更好的净化效果。

四、氨苯砜及其代谢物残留量的检测方法

由于兽药残留种类及代谢产物多样，其分析要求检测方法应具有灵敏度高、线性范围宽、特异性强、高通量等特点。目前，国内外关于动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留量的检测均有相应的研究和报道，DDS残留检测方法的建立始于20世纪70年代，随着新技术的不断出现，DDS及其代谢产物的检测方法可大致分为3类，即仪器分析法、免疫分析法和化学发光分析法。各种检测方法及检测结果见表2。

（一）仪器分析法该类方法主要是指基于色谱和质谱分析技术发展起来的定性定量检测技术。色谱分析技术包括气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）。作为分离分析各种复杂混合物的重要方法，色谱分析技术分离效率高、速度快、可进行大规模的纯物质制备。质谱分析技术（MS）不仅具有独特的选择性和灵敏度，还有精确的相对分子质量和结构信息分析能力。色谱－质谱联用技术将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度、强大的定性能力相结合，成为目前兽药残留分析领域中最强大的分析手段，最有力的定性定量工具，主要包括气相色谱－质谱联用（GC－MS）和液相色谱－质谱联用（LC－MS）。其中，HPLC和LC－MS可用于氨苯砜及其代谢产物N－乙酰氨苯砜残留量的检测。

1.高效液相色谱法。HPLC采用一定的提取手段将被分析对象溶于可作为流动相的溶剂中，直接进行检测分析，具有柱效高、分析速度快、应用范围广等特点，可作为动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留量的检测方法。2000年，霍燕兰等[26]采用HPLC法对氨苯砜进行定量分析，可有效地将主成分和杂质分离，重现性好，结果准确度高；2003年，陈亮等[27]建立HPLC法测定固体分散体中氨苯砜含量，分离效果好，方法回收率高，可用于氨苯砜－固体分散体的质量控制；2008年，韩现芹等[21]建立反相高效液相色谱法（RP－HPLC）测定牙鲆血浆中氨苯砜的浓度，该法操作简单，分离速度快，结果线性关系良好，最低检出限为0.01μg/mL；2013年，何丹等[28]建立RP－HPLC法测定氨苯砜的含量，结果准确，回收率高，可用来检测氨苯砜制剂的含量。国外研究中，HELA等[29]建立了用二极管阵列高效液相色谱法（HPLC－DAD）测定肌肉、肝脏和肾脏中氨苯砜含量，该方法在294 nm处检测苯砜类药物，检出限为1 ng/kg。

表2 氨苯砜及其代谢物残留的检测方法、回收率、检出限及相对标准偏差

2.液相色谱－质谱法。液相色谱－质谱法是一种检测复杂有机化合物的有效手段，被广泛应用于检测鱼肉、肌肉、内脏、鸡蛋和牛奶等动物源性食品中的氨苯砜及其代谢产物残留。谢洁等[22]建立了奶粉中氨苯砜残留检测的HPLC－MS/MS定量确证方法。该方法的检出限为0.05μg/kg，定量限为0.04 ng/kg，在0.04～0.4 ng/kg的添加范围内，回收率为88.5%～91.4%，变异系数＜7.7%。彭涛等[15]建立了HPLC－MS/MS定量确证方法，检测鸡肉组织中氨苯砜，检出限为0.015μg/kg，在0.05～5 μg/kg的添加范围内，回收率为76.2%～94.5%，变异系数小于19.4%。田云等[17]建立了液相色谱－电喷雾串联质谱（HPLC－ESI MS/MS）检测方法，检测动物组织中氨苯砜及其代谢产物N－乙酰氨苯砜，定量下限为0.5μg/kg，线性范围为0.5～5.0μg/kg，加标回收率为92%～103%，相对标准偏差为4.8%～11.0%。岑海蓉等[16]建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLC－MS）对牛肉、猪肉中的氨苯砜和N－乙酰氨苯砜进行检测，在实验浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均＞0.99，回收率为80%～113%，变异系数＜10%，定量下限达1.0 μg/kg。此外，国内相关标准GB/T 29706－2013、SN/T 2219－2008和GB/T 22940－2008均采用液相色谱－串联质谱法检测动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留量。在国外，RHIJN等[30]采用液相色谱串联质谱法对牛奶中残留的磺胺类化合物进行定量分析，其中对于氨苯砜残留的检出限为5μg/kg；HADJIGEORGIOU等[10]建立了HPLC－MS法用于测定猪肉和牛奶中的氨苯砜含量，检出限为5μg/kg。

（二）免疫分析法免疫分析法是以抗体作为分析试剂，对待检测物进行定量或定性分析的检测方法，也适用于动物源性食品中兽药残留的检测[31～32]。目前，关于免疫分析应用于氨苯砜残留检测的方法有酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法。

1.酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附法是以固相载体吸附抗原/抗体为基础，利用标记酶化学放大的灵敏性和抗体的特异选择性而建立起来的，从而利用标记物的酶催化底物的显色反应来反映抗原抗体结合的过程[33]。ELISA法前处理简化、特异性和灵敏度高、检测快速准确，具有广泛的实际应用价值，也适用于动物源性食品中氨苯砜及其代谢产物残留量的大批量、快速检测[34]。郑小娇等[23]建立直接竞争ELISA法，快速检测动物性食品中氨苯砜残留。结果显示，该方法的最低检出限达0.03 ng/mL，加标回收率为75.45%～91.75%。通过试验还表明，该检测方法对牛奶、蜂蜜、猪肉和鸡蛋的最低检出限分别可达到0.05、0.07、0.06和0.07 ng／mL；陶光灿等[24]建立了间接竞争ELISA法快速检测动物源性食品中氨苯砜残留量的方法。该方法对鸡肉和猪肉的检出限是0.2μg／kg，对鸡蛋和蜂蜜的检测限为2μg/kg，对牛奶的检测限为0.6μg／L，样品回收率可达78.2%～104.0%。

2.胶体金免疫层析法（CGIC）。胶体金免疫层析法是以胶体金标记技术为基础，使用金纳米颗粒标记抗体作为示踪物，结合抗原抗体的免疫反应检测样本中的痕量待测物。该方法可初步实现定量检测，操作简单，检测速度快，灵敏度较高，成本较低，适合现场和高通量快速检测[35]。赵兴然等[25]建立了GICA法，快速检测动物源性食品中氨苯砜残留含量，最低检出限为20μg/L。该方法操作简便、快速，适用于大批量临场动物源性食品中DDS残留的快速定性检测。

（三）化学发光分析法化学发光分析法是指根据某一时刻化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来测定物质含量的分析方法。该法仪器设备简单，灵敏度高，线性范围宽，分析速度快，但选择性比较差。关于应用化学发光分析法检测氨苯砜是将分子印迹技术应用到化学发光分析中，利用分子印迹聚合物的高选择性，从而提高化学发光分析的选择性。这两种方法结合是一种新型高选择性的在线测定新方法。在目前的研究进展当中，卢福广[20]建立了分子印迹－化学发光分析法（MI－CLA），用于检测动物源性食品和药物中氨苯砜的含量。通过制备氨苯砜分子印迹化学发光传感器，测定氨苯砜的工作曲线为 ΔI＝191.8+4.097×107c（mol/L）（R2＝0.998 3）， 该方法的线性范围为1.0×10－6～1.0×10－4mol/L， 检出限为5.3×10－7mol/L， 回收率为95%～103%。

五、结语

氨苯砜作为一种具有抗菌、抗炎作用的兽药，大剂量使用时显示杀菌作用，但其毒性较大，易经食物链传递危及人类健康。目前国内关于快速检测氨苯砜及其代谢产物的相关研究尚不完善，有待于进一步开发探索。对于氨苯砜及其代谢产物N－乙酰氨苯砜残留检测的前处理方法常用乙腈萃取，正己烷去脂，HLB和MCX固相萃取法净化，而分子印迹技术作为新兴前处理技术，以其较好的净化特点极具“发展潜力”。目前对于检测方法的研究主要是基于液相色谱－串联质谱法，该法灵敏度高，回收率好，能检测痕量水平的残留，但仪器设备昂贵；免疫分析法能够缩短分析时间，降低成本，但抗原抗体的制备较为复杂，应用具有一定的局限性；化学发光分析法作为一种新型检测方法发展前景虽好，但检测器和发光材料的制备较为复杂。因此，探究针对不同基质的动物源性食品，对样品的前处理方法和检测方法进行改进和优化，建立简便、灵敏和自动化程度高的样品前处理分析检测联用技术，将具有广泛的发展空间和应用潜力，对于动物源性食品中氨苯砜及其代谢物残留量的检测和监控具有重大意义。