张守梅 张娜娜 王兴亚 陈利容 郭玉秋 刘开昌 龚魁杰

（山东省农业科学院作物研究所，济南250100）

谷物易受多种真菌污染。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，全世界约有25%的粮食遭受不同程度的真菌及毒素污染[1]。真菌污染不仅可能会导致粮食品质下降、损失率增加，部分真菌次级代谢产物还有致癌、致畸、造成死亡等危害。由镰刀菌产生的呕吐毒素主要作用于消化系统的胃和肠道，黄曲霉产生的黄曲霉毒素是致癌、致畸最强的毒素，另外还有玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素等。这些真菌毒素污染的谷物制成饲料，会通过食物链导致肉、奶和蛋制品含有毒素，给人畜增加了巨大的安全隐患。

目前在粮食安全储藏应用中常用热处理、电子束辐照、臭氧储存等物理方法[2～4]和吡咯苯类、咪唑类、硫氰酸类等化学杀菌剂[5]来抑制或杀死有害微生物。物理方法虽然安全性高，但操作繁琐、成本高、对参数调节要求严格。使用化学农药虽然可以抑制虫蚀，降低霉变损失，但是环境污染重，容易造成粮食本身的营养流失以及食品安全问题。植物精油是从植物组织中提取出来的具有芳香气味、常温下能挥发的油状液体，其成分复杂，主要是萜类化合物，有的含有脂肪族化合物或小分子芳香族化合物[6]。研究表明，植物精油对植物病原真菌[7～9]、细菌[10～12]和病毒[13]均有一定的抑制效果。此外，植物精油还可应用于食品保鲜、驱虫医药等领域[14～15]。

小麦是山东省主要的粮食作物。控制仓储过程中真菌爆发，保证粮食不受真菌毒素污染是当前粮食产后减损的重要手段之一。本文针对山东省禹城市农户储粮小麦的表面污染真菌进行分离培养，选取6种植物精油对优势真菌抑菌活性进行研究，并筛选抑菌效果良好的精油，确定复配比例，并应用到粮食仓储中。

一、材料与方法

（一）材料与试剂本试验所用小麦样品取自山东省德州市禹城市农户家普通仓储小麦，用无菌自封袋装，当天带回实验室进行污染真菌的分离。

试验所用植物精油为肉桂精油、花椒精油、丁香精油、牛至精油、冬青精油、柠檬精油，均为单方精油，购自广东晶晶生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），北京陆桥技术有限公司；乳酸、甘油、无水乙醇、75%消毒酒精、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、丙酮、磷酸铵、乙二胺四乙酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；通用引物ITS1/ITS 4、2×Taq DNA Master Mix均由青岛擎科生物测序有限公司提供。

（二）仪器与设备SW－CJ－2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；电子天平，赛多利斯（上海）贸易有限公司；XW－80A旋涡混合仪，上海沪粤明科学仪器有限公司；恒温金属浴，米欧仪器；LDX－50KBS立式自动压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；Axio Observer倒置荧光显微镜，德国蔡司；台式离心机，Eppendorf公司；PCR仪，Heal Force生物公司。

（三）真菌的分离纯化鉴定

1.真菌的分离和纯化。在超净工作台中，取10 g小麦样品于装有90 mL无菌去离子水的锥形瓶中，密封后以200 r/min于室温下振荡30 min，并将上清液依次稀释至0.1、0.01、0.001、0.000 1的浓度梯度，分别取100μL涂布在含青霉素和硫酸链霉素的PDA培养基中，28℃培养3～5 d后进行菌落的分离纯化，纯化后的真菌用无菌保种管4℃保存。

2.真菌的鉴定。观察菌落颜色、大小，菌丝形态等特征，制作临时装片，在摄像显微镜下观察菌丝表面形态、分生孢子梗和分生孢子的着生情况、大小形态等特征，进行形态学初步鉴定。

利用热裂解法[16]提取菌落基因组，并进行基于18 s核糖体DNA的内转录间隔区（Internal Trans cribed Spacer，ITS）的序列鉴定，通用引物为ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’和ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’。

PCR扩增反应体系（25μL）：2×Taq PCR MasterMix，12.5μL； 模板DNA，1μL； ITS1，1 μL； ITS4，1μL； ddH2O补足至25μL。反应条件为95℃预变性3 min，94℃1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；4℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带明亮清晰的样品送往青岛擎科测序公司测序。

（四）精油抑菌试验滤纸片法[17]进行抑菌圈测定。制备所分离纯化的真菌菌悬液，使其浓度为1×106～5×106CFU/mL。取100μL菌液均匀涂布到PDA平板中，制成带菌平板。吸取精油5μL加入到无菌滤纸片中，3个滤纸片均匀分布到平板表面，封口膜密封后室温环境下培养7 d，测量抑菌圈直径。设置空白对照，每个处理重复3次。

抑菌圈试验判定标准参考：抑菌圈直径>20 mm，高度敏感；直径为10～20 mm，中度敏感；直径为5～10 mm，低度敏感。

（五）最小抑菌浓度（MIC）测定在无菌培养皿中倒入20 mLPDA培养基，冷却凝固后，将100μL菌悬液涂布到含有PDA的平板上，制成含菌平板。精油稀释后，滴加到滤纸片中，每片滤纸片加入10μL精油稀释液，将滤纸片贴于平皿中央，封口膜封口。精油在平皿中培养基上方的空气浓度为0～15μL/mL。以无菌丝生长的最低精油浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

（六）联合抑菌实验选择抑菌效果好的单方精油，以不同的比例配合，复配后的精油以丙酮作为稀释液，吸取一定量的稀释液滴加到滤纸片中，将滤纸片置于含菌平板中，封口膜封口后，室温下培养7 d。以无菌丝长出的最低浓度为复合精油的MIC。联合抑菌效果评价：以分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）作为联合抗菌试验效果的判定依据[18]。

FIC指数判定标准：FIC指数≤0.5时，为协同作用；0.52时，为拮抗作用。

（七）数据分析所有数据均测定3次，取3次平均值作为测定结果。用Microsoft Excel进行统计，用IBMSPSS Statistics 21软件进行单因素方差分析（P<0.05）。

二、结果与分析

（一）真菌的分离鉴定

1.真菌的形态学鉴定。从仓储小麦中分离的真菌数量最多的为曲霉属、青霉属、链格孢属、镰刀菌属，另外还有少量的酵母菌、根霉、黑孢霉、枝孢属真菌。其中优势真菌如图1所示，根据 《真菌鉴定手册》[19]结合所分离真菌的菌落和显微形态，可以初步鉴定图1a为黄曲霉菌；图1b为尖孢镰刀菌；图1c为草酸青霉；图1d为链格孢菌。

图1 小麦污染真菌菌落及显微形态（40×10）

2.真菌的分子鉴定。对优势真菌ITS序列测序结果在NCBI数据库中在线比对，选择相似度高的菌株序列，利用MEGA7.0，采用最大似然法构建系统发育树（见图2）。

图2 优势污染真菌基于ITS序列的系统发育树

（二）单一植物精油对污染优势真菌的抑制效果6种植物精油对4种真菌的部分抑菌效果如图3所示，测量抑菌圈直径（包含滤纸片直径），其结果见表1。

图3 部分精油抑菌活性图

表1 单一植物精油的抑菌效果

其中以肉桂精油和牛至精油对污染优势真菌的抑菌效果最好，4种污染真菌对二者均高度敏感；其次是丁香精油和冬青精油，但冬青精油对黄曲霉不具有抑菌作用，其他3种真菌对冬青精油高度敏感，4种真菌对丁香精油均高度敏感，但除链格孢外，对其他3种真菌的抑菌直径均显著小于肉桂精油和牛至精油（P<0.05）；污染真菌对花椒精油中度敏感，对柠檬精油低度敏感，且花椒精油对黄曲霉、柠檬精油对黄曲霉和链格孢菌均无抑菌效果。结果表明，肉桂精油和牛至精油对4种污染真菌的抑菌效果最好，可以认为肉桂和牛至两种植物精油对小麦储藏期间的污染真菌具有广谱抑菌效果。

（三）单一植物精油的最低抑菌浓度MIC是指能够完全抑制病原菌生长的最小浓度，MIC越小，说明精油对病原真菌的抑菌活性越强[20]。为了解各植物精油对小麦储藏期间优势污染真菌的抗菌效果，通过测定各植物精油的最低抑菌浓度（MIC）对其抗菌效果进行分析，结果见表2。肉桂精油对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好，MIC值为0.9±0.1μL/mL，对黄曲霉菌、链格孢菌和草酸青霉的MIC值分别为3.5±0.1、4.6±0.1、6.9±0.1 μL/mL；牛至精油对黄曲霉的抑菌效果最好，MIC为2.7±0.1μL/mL，其次是草酸青霉、尖孢镰刀菌和链格孢菌， 分别为3.0±0.1、3.1±0.6、3.5±0.1 μL/mL；丁香精油对草酸青霉和链格孢菌的抑菌效果最好，MIC分别为3.3±0.2、3.4±0.2μL/mL， 其次是黄曲霉和尖孢镰刀菌分别为6.7±0.1、6.8±0.4 μL/mL；冬青精油对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好，MIC为3.5±0.1μL/mL，其次是链格孢和草酸青霉，MIC分别为6.3±0.4、6.8±0.2μL/mL， 但对黄曲霉无抑菌效果；柠檬精油和花椒精油无法完全抑制4种真菌的生长，抑菌效果较差。

（四）复合精油的联合抑菌效果评价对抑菌效果较好的精油按照不同比例进行复配，可以提高植物精油的广谱抑菌活性[21]。根据单方精油的抑菌直径和最低抑菌浓度，选用肉桂精油和牛至精油分别按照肉桂与牛至1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1的比例进行复配，其联合抑菌效果如表3所示。由表3中结果可见，肉桂精油和牛至精油的FIC指数均≤0.5，说明两者在不同的复配比例下对真菌的抑菌为协同作用。肉桂精油∶牛至精油为1∶2时，FIC指数最低，此时两者协同抑菌效果最佳，对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好，最小抑菌浓度为0.08μL/mL；其次是黄曲霉，MIC为0.12 μL/mL；草酸青霉，MIC为0.21μL/mL；链格孢菌，MIC为0.31μL/mL。肉桂精油∶牛至精油为1∶2时，对4种真菌的空气抑菌浓度为0.31 μL/mL时抑菌效果最好。

表2 单一植物精油的最低抑菌浓度指数

表3 肉桂精油和牛至精油复合精油的最低抑菌浓度和分级抑菌浓度指数

三、讨论

本研究结合形态学和分子生物学基于ITS序列鉴定，从农户储藏小麦中分离出污染优势真菌分别为黄曲霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌和青霉菌4种污染真菌，这与前人从储藏小麦中分离出的污染优势真菌的结果相一致[22～23]。研究表明，黄曲霉的次级代谢产物黄曲霉毒素具有强烈的致癌作用，镰刀菌产生的次级代谢产物呕吐毒素（DON）作用于人畜消化道，引起中毒现象，链格孢菌是小麦黑胚病的主要病原菌，而青霉属真菌是粮食储藏不当，导致霉菌爆发的主要原因。因此这4种真菌是引起粮食安全的重要原因。

植物精油本身是一种高效安全的植物源抑菌或杀菌剂，目前已经被广泛用作植物病害防治中。董路路等[24]研究发现，牛至精油、肉桂精油和丁香精油对青霉菌具有较强的抑制效果；赵娜娜等[9]发现，肉桂精油对萎蔫专化型尖孢镰刀菌具有较好的抑菌活性；徐丹等[25]发现，肉桂精油能够对黄曲霉菌丝体和孢子造成严重损伤，对黄曲霉生长和产毒的抑制率高达100%；有研究发现，肉桂精油、牛至精油和丁香精油对容易引起果蔬真菌病害的链格孢菌具有较强的抑菌效果[26～27]。本研究对单一精油的抑菌结果显示，肉桂精油、牛至精油对黄曲霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌和青霉菌的抑菌效果最佳，以肉桂精油对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好，MIC为0.9μL/mL，花椒精油、柠檬精油和冬青精油对黄曲霉菌不具有抑菌效果，柠檬精油对链格孢菌无抑菌作用。

有大量的研究证明，对不同植物精油进行复配的抑菌效果更优于单一精油的抑菌效果。曲春阳[28]利用肉桂精油与大蒜精油3∶1的比例进行复配对大米中黄曲霉菌的抑菌效果最好。JORGE等[29]将牛至精油和马郁兰精油、百里香精油复配均对病原菌具有相加的抑菌效果。本试验对肉桂精油和牛至精油进行不同比例复配，发现肉桂精油和牛至精油在不同配比下均呈现协同抑菌的效果，且以1∶2的配比下两种精油的协同抑菌效果最佳。其机理可能是协同作用的精油对病原菌细胞壁活性成分和保护性酶的连续抑制作用，增强了细胞对精油活性成分的吸收，进一步达到破坏细胞膜，抑制甚至杀死病原菌的效果[30]。

植物精油对粮食储藏过程中有害微生物的抑制作用目前以理论研究居多，接下来本研究将根据本次研究结果及前人的经验，初步开展小粮仓储粮过程中植物精油防霉包的研发和应用。王利敏[31]利用肉桂精油、柠檬精油、丁香精油和薄荷精油按照一定比例制成防霉剂对储藏在仓库中的玉米进行为期12个月的熏蒸处理，发现精油防霉剂处理对菌落总数的抑制率高达89%，对黄曲霉和镰刀菌的抑制率达到99.4%和100%，并能够有效抑制真菌毒素的合成。刘晓丽等[32]在恒温恒湿条件下对大米进行模拟储藏，探究肉桂精油对粮食储藏中常见的霉菌的抑制作用，发现肉桂精油浓度在150 mg/L以上时，大米没有发生霉变现象；在175 mg/L以上时能够完全抑制霉菌孢子的生长。也有学者利用植物精油对粮仓进行熏仓，能够抑制或杀死储粮常见害虫，起到驱虫、避虫和杀虫的效果[33]。植物精油作为一种安全性高、操作简单的防霉抑菌剂，应用在粮仓储存中具有重大的研究和开发价值。

四、结论

本研究结果表明，肉桂精油、牛至精油、冬青精油、丁香精油、花椒精油和柠檬精油对从储藏小麦中分离出的优势病原真菌黄曲霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌和草酸青霉的抑菌效果不同，以肉桂精油和牛至精油的抑菌效果最好，抑菌圈直径均在42 mm以上；采用肉桂精油和牛至精油以不同的比例进行复配，发现两者具有协同抑菌效果，且以1∶2比例复配时对4种优势污染真菌的协同抑菌效果最好。因此肉桂精油和牛至精油按照一定比例复配，可作为一种具有良好应用前景的粮食防霉保鲜剂。