赖 慧 赖洪林 陈 立 任 维 杨思进 赵福兰

蟾酥在《药性论》和《日华子本草》中被称为“蟾蜍眉脂”和“蟾蜍眉酥”，由中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺和皮肤腺的白色分泌液干燥而成[1]。属特殊管理的28种有毒中药之一[2]。据《中药大辞典》记载，蟾酥“有毒，能破瘾结，行水湿，化毒，杀虫，定痛”。据《本草汇言》记载，“蟾酥，疗疳积，消膨胀，解疗毒之药也”[3]。蟾酥药理作用多，成分复杂，有很强的抗肿瘤活性[4]。有研究表明，蟾酥与索拉非尼联合作用可引起人肝癌HepG2细胞S期周期阻滞[5]。蟾酥注射液是从中华大蟾蜍耳后腺分泌液中提取的水溶性药物，主要含吲哚碱衍生物，包括蟾毒灵、华蟾毒配基和酯蟾毒配基等，现作为抗肿瘤辅助药物[6, 7]。将蟾酥注射液联合肝动脉内插管化疗栓塞术治疗原发性中晚期肝癌，患者病程可明显缓解[8]。曲金荣等[9]研究发现蟾酥注射液还能降低原发性肝癌引发的肝损害。但蟾酥注射液对于肝癌的凋亡诱导机制还不够明确。因此本研究选取蟾酥注射液为研究对象，观察其对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制和凋亡诱导作用，为肝癌的临床治疗提供实验依据。

材料与方法

1.材料：人肝癌SMMC-7721细胞由西南医科大学药学院肿瘤药理实验室惠赠。蟾酥注射液购自江苏浦金药业有限公司。胰酶细胞消化液、CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。

2.细胞培养：快速融化从液氮中取出的SMMC-7721细胞，离心后用完全培养基(含10 %胎牛血清，1%青链霉素)重悬，随后置于细胞培养箱中培养。当7721细胞快要铺满培养瓶瓶底时，进行细胞传代。

3.CCK-8细胞增殖抑制实验：将7721细胞以6×103/ml的密度接种于96孔板中，24h后，加入不同浓度的蟾酥注射液，每组设复孔3个。药物作用24、48及72h后，加入CCK-8试剂，孵育30min后测定各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。该实验重复3次。

4.ROS检测实验：将7721细胞制成密度为1×104/ml的悬液接种于6孔板中，细胞贴壁生长后，药物处理48h，收集细胞，装载DCFH-DA探针。培养箱中孵育20min后，用无血清培养基洗涤3次，流式细胞仪检测各组ROS水平。该实验重复3次。

5.线粒体膜电位荧光观察实验：将7721细胞以1×104/ml的密度接种于玻璃小皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度的蟾酥注射液，药物作用48h 后，进行JC-1染色。染色时孵育20min。随后用1×的JC-1染色缓冲液冲洗2次。置于激光共聚焦显微镜下观察。该实验重复3次。

6.细胞凋亡率检测实验：将7721细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×104/ml。24h后用不同浓度的蟾酥注射液处理48h，收集细胞，PBS清洗1遍，每孔再分别加入200μl nnexin V-FITC结合液，5μl PI染色液和2μl Annexin V-FITC染色液并混匀，避光染色20min(室温)，流式细胞仪检测其凋亡率。该实验重复3次。

7.统计学方法：采用GraphPad Prism 5.0统计学软件对数据进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用One-wayANOVA单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.蟾酥注射液对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用：不同浓度蟾酥注射液处理后的7721细胞增殖活性明显受到抑制(表1)，与对照组比较，蟾酥注射液对7721细胞的抑制作用随药物浓度的增大而增加，差异有统计学意义(P<0.05)；同一浓度的蟾酥注射液对7721细胞的抑制作用随药物作用时间的延长而增大，差异有统计学意义(P<0.05)。蟾酥注射液作用7721细胞24、48及72h后，IC50分别为2.60±0.01、2.00±0.10和1.57±0.17μg/L。

表1 CCK-8法检测蟾酥注射液对SMMC-7721细胞增殖抑制率的影响

2.SMMC-7721细胞内ROS水平：根据IC50结果，选取低、中、高浓度分别为1.0、2.5和5.0μg/L的蟾酥注射液作用于7721细胞48h，测得各组ROS荧光值变化(图1)。荧光强度峰值逐渐右移，ROS水平以百分比(%)表示。7721细胞内ROS水平随蟾酥注射液浓度的增加而增加，与对照组(9.60%±2.80%)比较，1.0、2.5和5.0μg/L药物处理组的ROS水平(66.35%±3.29%、82.92%±1.90%和85.17%±1.72%)均有明显增加，差异有统计学意义(P=0.000)。

图1 流式细胞仪检测SMMC-7721细胞中ROS表达水平

3.SMMC-7721细胞线粒体膜电位变化：用不同浓度的蟾酥注射液分别处理7721细胞48h后，观察到各组线粒体膜电位荧光变化随药物浓度的增加，绿色荧光逐渐增强，而红色荧光逐渐减弱(图2)。

图2 荧光染色法检测SMMC-7721细胞线粒体膜电位变化(JC-1染色，×200)

4.SMMC-7721细胞凋亡率：不同浓度蟾酥注射液作用7721细胞48h后，对照组7721细胞的总凋亡率为10.08%±0.70%，1.0μg/L蟾酥注射液组细胞总凋亡率为17.33%±3.20%，与对照组比较凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。2.5、5.0μg/L蟾酥注射液组细胞总凋亡率分别为25.60%±1.05%和35.76%±4.72%，与对照组比较，凋亡率明显增加，差异有统计学意义(P=0.000，图4)。

图3 流式细胞术检测SMMC-7721细胞凋亡率

图4 蟾酥注射液对SMMC-7721细胞凋亡的影响

讨 论

原发性肝癌是目前我国第4常见的恶性肿瘤，在肿瘤致死病因中位列第2位，潜伏期长，病死率高，严重威胁人民的生命健康[10]。目前，西医治疗肝癌的主要方法是通过手术切除肝癌肿块，但手术风险大，很多患者无法耐受[11]。近年来，中医药的不断发展，为肝癌的治疗提供了新思路。中医认为癌毒是肝癌发生的关键，虞抟在《医学正传》中记载，“大毒之病，必用大毒之药以攻之”，有研究者因而采取以毒攻毒法治疗肝癌，临床疗效显著[12]。蟾酥作为动物类毒性中药之一，其制剂对肝癌的作用已成为研究的热点。本研究体外实验证实了蟾酥水提取物中药制剂——蟾酥注射液对SMMC-7721细胞具有明显抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。

本研究中1.0、2.5和5.0μg/L的蟾酥注射液处理组细胞ROS水平与对照组比较均有明显增加。生理状态下，细胞内的ROS主要由细胞的线粒体氧化产生，其产生和清除之间保持动态平衡[13]。当ROS积累过多时，线粒体渗透性转运孔上的相应敏感位点被氧化，进而发生氧化性损伤[14]。有研究表明, 大量的ROS能够启动细胞的凋亡级联反应，诱导细胞凋亡[15]。本研究证实了蟾酥注射液可以增加ROS水平，可以推测这与7721细胞凋亡有关。

线粒体是细胞的能量代谢中心，但其DNA缺乏组蛋白的保护，易发生损伤。在受到ROS攻击后易发生脂质过氧化改变，导致膜通透性增加，释放细胞色素C，激活凋亡蛋白caspase-3，引起细胞凋亡[16]。线粒体膜电位是膜两侧离子浓度不同而产生的跨膜电位差，是反映线粒体功能状态的重要指标[17]。细胞凋亡的早期通常伴随线粒体膜电位下降[18]。本研究选择的荧光探针JC-1在细胞线粒体膜电位较高时，会形成聚合物，发出红色荧光，而膜电位较低时，则为单体，发出绿色荧光，因此观察JC-1荧光颜色的变化可以确定线粒体膜电位的变化。本研究中，不同浓度的蟾酥注射液分别作用于7721细胞48h后，激光共聚焦显微镜观察到随药物浓度的增加，绿色荧光越来越强，而红色荧光越来越弱，可见，给药组线粒体膜电位随药物浓度增加而下降，7721细胞线粒体损伤程度随药物浓度增加而越来越严重，这种变化与蟾酥注射液引起的ROS水平变化呈一定相关性，提示蟾酥注射液引起的7721细胞线粒体损伤，可能与线粒体受到高浓度ROS的氧化攻击有关。本研究通过检测7721细胞总凋亡率进一步证实蟾酥注射液浓度越高，细胞总凋亡率越大，可以推测蟾酥注射液可损伤线粒体，使线粒体膜电位下降，诱导7721细胞凋亡。

综上所述，本研究验证了蟾酥注射液可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，并诱导7721细胞凋亡，该凋亡可能与蟾酥注射液引起7721细胞ROS含量增加、进而导致线粒体损伤、膜电位下降有关。本研究为蟾酥注射液对肝癌的临床治疗奠定了一定的实验基础，但相关研究结论并未通过体内实验予以证实，所以还有待于开展深入研究。