李文波 郎 曼 迪力娜尔·买买提 袁翠杰 陈佩弟 谢惠芳

慢性砷中毒是一个重大的公共卫生问题，近70个国家，超过2亿人长期饮用砷超过10μg/L的饮用水[1, 2]。而饮用水中的砷主要以无机砷的形式存在，1979年，无机砷被国际癌症研究中心确认为人类皮肤及肺的致癌物[3, 4]。皮肤损伤是慢性砷中毒最突出的临床症状，轻度损伤表现为接触性皮炎，重度损伤可能出现色素沉着、角化过度、细胞癌变等[5]。砷致皮肤损伤的机制至今仍不明确。本研究通过14周亚砷酸钠(NaAsO2)慢性染毒SD大鼠的体内实验，记录大鼠体质量、脏器质量，镜下观察皮肤组织病理改变，研究砷对SD大鼠皮肤组织的毒性损伤，为进一步探讨砷致SD大鼠皮肤损伤的机制提供理论基础。

材料与方法

1.实验动物：健康成年无特定病原级(specific pathogen free，SPF)SD大鼠50只，雌雄各半，体质量206±11g，购自新疆医科大学实验动物中心[生产许可：SCXK(新)2016-0003；使用许可：SYXK(新)2016-0002]。实验期间大鼠自由摄食饮水，饲养温度18～22℃，相对湿度40%～60%，室内动物照明灯，照度15～20lx，12h昼夜交替。

2.主要试剂：NaAsO2(德国MERCK公司)，N-乙酰半胱氨酸(上海源叶生物科技有限公司)，水合氯醛(上海山浦化工有限公司)，4%多聚甲醛(BIOSHARP)，乙醇(成都科龙化工试剂厂)。

3.动物分组及染毒：按性别体质量随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和高剂量干预组，每组10只，雌雄各半，以预实验测得NaAsO2的LD50的0、1/100、1/20、1/4确定染毒剂量为0、0.46、2.3、11.5mg/kg，自由饮水进行染毒，共14周。第10周，高剂量干预组饮用高剂量砷溶液的同时，按照20mg/kg体重的剂量连续4周每天灌胃N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)。实验期间观察大鼠精神及活动状况，皮毛光泽度，记录饮水量和进食量，每周测定体质量，染毒结束后，10%水合氯醛处死大鼠。

4.取样：处死前禁食，正常饮用超纯水或含砷水，麻醉后背部脱毛，取全厚皮肤，置于4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中，4℃冰箱保存。

5.样本处理：HE染色，光镜下观察各组大鼠皮肤组织形态；醋酸铀-枸橼酸铅染色，电镜下观察各组大鼠皮肤组织超微结构。

6.脏器系数计算：称量脏器重量，计算脏器系数，脏器系数=脏器重量(g)/体质量(g)×100%。

结 果

1.SD大鼠一般状况：实验期间，对照组大鼠生长发育良好，活动正常，饮水量、饮食量正常，皮毛光滑，无异常表现；与对照组比较，染毒4周时，各剂量组大鼠颈背部出现不同程度毛色发红；随着染毒时间延长，各剂量组大鼠活动减少，应激性差，颈、背部出现不同程度的皮毛脱落，各剂量组大鼠出现不同程度的气喘症状，其中以中、高及高剂量干预组最为明显；高剂量干预组大鼠灌胃NAC后，气喘症状有所缓解，饮水量、饮食量、活动量增加；染毒第8周，高剂量组1只大鼠出现血尿。

2.SD大鼠体质量变化情况：前4周，大鼠体质量增长最快；第8周，除对照组外，其他剂量组大鼠体质量增长缓慢，雄性高剂量组体质量下降，与雄性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；第12周，高剂量组大鼠体质量低于其他剂量组大鼠，与低剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。第14周，同雄性低剂量组比较，雄性中、高剂量组体质量明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。染毒期间，各组雌性大鼠体质量存在一定差异，但差异无统计学意义(P>0.05，表1，表2)。

表1 NaAsO2对雄性SD大鼠体质量的影响

表2 NaAsO2对雌性SD大鼠体质量的影响

3.脏器系数变化：与对照组比较，中剂量组大鼠心脏及肺部脏器系数增大，差异有统计学意义(P<0.05)。其他脏器系数间比较，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

表3 NaAsO2对各组SD大鼠脏器的影响

4.SD大鼠皮肤组织病理学变化：(1)光镜下变化：对照组大鼠皮肤组织形态正常，各层结构清晰，细胞排列正常；低剂量组角质层、颗粒层增厚，皮下血管慢性炎细胞浸润；中剂量组表皮层较薄，颗粒层增厚，炎细胞浸润；高剂量组表皮层明显变薄萎缩，棘细胞增多，排列紊乱，皮下部分结缔组织纤维黏液样变化，黑色素细胞增多；高剂量干预组表皮层萎缩，炎细胞浸润(图1)。(2)透射电镜下变化：对照组大鼠皮肤组织层次清晰，结构完整，连接紧密，未见异常；低剂量组角质层、颗粒层增厚，棘细胞核轻微异常；中剂量组角质层增厚，细胞间隙增宽，连接松散，棘细胞异形增多，细胞质溶解，细胞核固缩；高剂量组异形核细胞增多，异染色质增多、黑素小体增多，细胞器减少，微丝减少；高剂量干预组细胞核肿胀、畸形，细胞器溶解，透明度增加，桥粒减少(图2)。

图1 光镜下各组SD大鼠皮肤病理学改变情况(HE，×200)

图2 电镜下各组SD大鼠皮肤病理学改变情况(醋酸铀-枸橼酸铅染色)

讨 论

砷作为环境致癌物，通过多种途径造成人体内蓄积并引起多脏器损伤及功能障碍，严重时可引发癌前病变[6, 7]。然而，也有相关研究证实低剂量砷对机体生长发育有促进作用，本实验中，低剂量组大鼠生长发育良好，体质量呈上升趋势，饮水量饮食量不断增加，尤其是雄性大鼠，第8周后，体质量逐渐超过其他剂量组，第12周，体质量明显高于雄性高剂量组，第14周，明显高于雄性中、高剂量组，差异均有统计学意义。长期饮用高剂量砷溶液对机体的损伤作用也得到证实[8]。本实验中，随着染毒剂量的增加，中、高和高剂量干预组大鼠饮水量和饮食量逐渐减少。从第8周开始，雄性高剂量组大鼠体质量明显降低。此外各染砷剂量组大鼠均出现不同程度的健康状况恶化，高剂量组1只大鼠出现血尿，提示长期饮用高剂量砷水可能对肾脏造成损伤；染毒期间，各染砷剂量组均出现气喘等症状，以中剂量组最为明显，分析脏器系数可知，中剂量组大鼠心脏、肺部脏器系数明显高于对照组，证实了长期饮用含砷水会对机体肺部造成损伤，与徐梦伟等[9]的研究结果一致。高剂量干预组在给予NAC后，健康状况好转，呼吸系统症状有所改善，与黄佳等[10]的报道一致，不同染砷剂量组间，脏器系数除心脏、肺部外，其他脏器系数存在轻微差异，但差异无统计学意义。

皮肤作为砷毒作用的主要器官，是最早出现病变的部位[11, 12]。本实验中，除部分大鼠颈背部毛发发红、脱落外，没有出现色素沉着、角化异常等肉眼可见的皮肤病理改变。流行病学调查发现，砷暴露达到一定积累剂量时，皮肤损伤症状可呈剂量-反应关系，低于积累计量时，其皮肤损害作用并不明显[13]。建立砷致皮肤损伤的动物实验模型仍存在一定困难，染毒的剂量设计、实验动物的选择、染毒方式、染毒周期及造模终点的确定尚需开展大量研究。因此目前大多通过皮肤组织病理切片来观察砷对皮肤组织的损伤，本实验中，与对照组比较，光镜下各组出现不同程度慢性炎细胞浸润，表皮层萎缩，结缔组织纤维黏液样变化等；电镜下可见各组出现不同程度角质层增厚，细胞间连接松散，异染色质增多，色素沉着，细胞质溶解，微丝减少，细胞核固缩、畸形等。表明亚砷酸钠染毒可导致皮肤细胞损伤。

砷易与皮肤组织中的巯基结合，形成稳定的络合物或环状化合物，抑制多种巯基依赖酶活性，影响细胞正常代谢、氧化呼吸及染色体结构[14]。因此砷中毒最突出的早期症状表现为皮肤脱色、着色和角化。NAC已广泛应用于临床，主要用于肺部疾病的治疗。本实验中，NAC作为巯基补充物，给药后，高剂量干预组大鼠健康状况明显好转，与高剂量组比较发现，光镜下高剂量组皮下部分结缔组织纤维黏液样变化，黑色素细胞增多；电镜下高剂量组黑素小体明显增多。相关研究证实砷摄入会抑制巯基活性导致酪氨酸酶活性增加，进而产生黑色素，最终形成色素沉着。NAC作为巯基补充剂，可抑制酪氨酸激酶的激活，从而降低黑色素的生成。在砷致小鼠皮肤黑色素合成实验中发现NAC可以减缓砷对小鼠皮肤的损伤[15]。目前国外对NAC在皮肤疾病中的治疗报道较多，NAC临床治疗皮肤疾病具有疗效好、不良反应较少等优势[16]。我国治疗砷中毒型皮肤损伤药物以二巯基丙磺酸钠为主，但该药物不良反应明显，NAC是否能作为砷中毒型皮肤损伤的治疗药物仍需要进一步研究。

综上所述，通过长期饮水砷暴露，会对SD大鼠产生不同程度的毒性作用，皮肤损伤以细胞坏死、表皮萎缩、黑色素增多、角化过度为主，且毒性作用随着剂量增大而加重，进行NAC的干预治疗后，可能在一定程度上缓解NaAsO2对SD大鼠皮肤组织的损伤。