钟丽娟 赵新海

摘要：以污染香菇菌棒和黑木耳菌棒的木霉为来源，筛选到一株适用于菌糠发酵的木霉菌株X-05，对峙培养试验结果表明，菌株X-05对番茄灰霉病病菌和黄瓜枯萎病病菌均具有较好的抑菌效果。以废弃香菇菌糠、黑木耳菌糠作为培养基质，测定外源氮源、水分及pH值对木霉菌丝生长及产孢的影响，结果表明，香菇菌糠、黑木耳菌糠均适合木霉生长，在尿素添加量为3%、料液比为1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值为4.5～5.0的条件下，于30 ℃培养7 d后香菇菌糠、黑木耳菌糠的产孢量可达3.67×109～7.00×109 CFU/g。

關键词：香菇;黑木耳;菌糠;绿木霉;pH值

菌糠是指食用菌菌棒采收后废弃的固体培养料，其成分主要为尚未被完全利用的纤维素、木质素、粗脂肪和食用菌菌丝体等。目前，食用菌产业已经成为我国第六大种植产业，产量已超过3 000万t，同时产生了大量废弃菌糠。近年来，研究人员针对菌糠的综合利用开展了大量研究，主要集中在将其用作畜禽饲料、有机肥料、蔬菜基质、生物质颗粒、食用菌培养料等方面[1-3]，积极推动了食用菌产业链条的延长。此外，生物防治土传病害的潜力和效果越来越得到重视，其中利用木霉菌防治作物各类病害的效果及其作用机制已有大量相关报道，美国、以色列、中国、印度、瑞典等多个国家已经实现木霉制剂的商品化应用[4-6]。但在实际生产中，生物防治常存在使用成本高、见效慢、产品货架期短等问题，其中见效慢是由生物防治与化学防治的作用机制不同造成的，而使用成本高、产品货架期短归根结底其实是由生防菌剂生产成本高、菌株抗逆性和定植能力差等导致的[7-8]。开展利用废弃菌糠培养木霉的研究，一方面可以解决木霉等生防菌定植难的问题，另一方面可有效资源化利用废弃菌糠，对于推广植物病害的生物防治和农业废弃物的资源化循环利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

木霉菌株来源于喀左县尤杖子乡香菇种植基地的香菇染菌棒和喀左县大营子乡黑木耳种植基地的黑木耳染菌棒。

番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum）由沈阳农业大学植物保护学院吴元华教授馈赠。

1.2 培养基

综合马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方：200.0 g马铃薯（去皮），20.0 g葡萄糖，1.5 g MgSO4·7H2O，3.0 g KH2PO4，18.0 g琼脂，1 000 mL蒸馏水，pH值为6.0。菌糠培养基配方：取粉碎后过60目筛的香菇菌糠细粉100.0 g，加入1 000 mL蒸馏水煮沸15 min，再加入琼脂20.0 g至完全溶化，定容至1 000 mL后，分装到500 mL三角瓶中。马丁氏培养基配方：5.0 g蛋白胨，10.0 g葡萄糖，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，20.0 g琼脂，1 000 mL 蒸馏水，pH值自然。每1 000 mL培养基中加3.3 mL 1%孟加拉红水溶液。临用时在每 100 mL 培养基中加0.3 mL 1%链霉素溶液。上述培养基于121 ℃灭菌30 min，冷却后备用。

1.3 原料来源

黑木耳菌糠取自辽宁省朝阳市喀左县大营子乡大营子村黑木耳种植基地，培养基配方如下：78%木屑、19%麸皮、1%石灰、1%石膏，出耳5潮后，自然风干、粉碎并混合均匀备用，经测定，pH值为569。香菇菌糠取自辽宁省朝阳市喀左县尤杖子乡后钢沟村香菇种植基地，培养基配方如下：78%木屑、19%麸皮、1%石灰、1%石膏，出菇5潮后，自然风干、粉碎并混合均匀备用，经测定，pH值为4.83。

1.4 菌株分离

在无菌条件下用剪刀将染菌棒剪开，用接种针挑取木霉产孢浓密部位的培养料，接种至事先倒好的综合PDA培养基上，每个样品设5次重复。将接种后的培养皿于28 ℃培养，定期观察菌落形态并进行镜检，挑取目的菌落边缘的菌丝，接种至综合PDA平皿中央进行纯化，根据菌落来源进行编号，纯化2～3次后，分别将菌种转接至斜面综合PDA培养基上，于28 ℃培养至斜面长满菌丝后，于4 ℃冰箱保存。

1.5 菌株筛选

1.5.1 菌株的初筛 挑取冰箱中保藏的、大小约为0.5 cm×0.5 cm的各菌株组织块，接种至综合PDA平板培养基中央，于28 ℃恒温培养48 h后，分别用6.0 mm打孔器打取菌落边缘菌丝，将菌苔分别接种至事先倒好的含有菌糠培养基的平皿中央，于28 ℃恒温培养，定期观察菌落的生长情况。培养72 h后，用游标卡尺采用十字交叉法测定木霉菌落的直径，挑选出3株在菌糠培养基上生长良好的木霉菌株并标记清楚，培养120 h后分别用20 mL无菌水洗涤平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液，适当稀释后采用计数器计数法测定孢子数量[9]。

1.5.2 菌株复筛 分别将初筛得到的3株木霉、番茄灰霉病病菌和黄瓜枯萎病病菌接种至事先倒好的综合PDA平皿中央，于28 ℃培养72 h（黄瓜枯萎病病菌需培养120 h）后，用6.0 mm打孔器沿菌落边缘打取菌落，将木霉接种至综合PDA平皿中央，番茄灰霉病病菌或黄瓜枯萎病病菌按等边三角形接种3点，通过对峙培养进行抑菌效果的测定。待木霉菌丝与病原菌菌丝接触后，用游标卡尺测定木霉和病原菌的菌落半径。通过初筛、复筛，确定1株木霉作为菌糠发酵用木霉菌株。

1.6 菌株鉴定

将复筛获得的木霉接种至综合PDA培养基上，用于观察菌落形态。另取平板，距离接种点约 2 cm，用灭菌镊子各斜插入4片灭菌盖玻片，用于观察菌丝、孢子等显微形态。将平板于28 ℃培养，定期观察菌落生长情况，及时进行分生孢子梗、分生孢子及菌丝的显微观察。

真菌的形态学鉴定参照魏景超的《真菌鉴定手册》[10]和Gams、Bissett的分类系统检索表[11]。

1.7 菌株生物学特性测定方法

1.7.1 温度试验 设置15、20、25、30、35、40 ℃等6个温度处理，培养基为综合PDA。

1.7.2 pH值试验 用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分别将综合PDA培养基的pH值调至3、4、5、6、7、8，制成不同pH值的培养基。将4 ℃冰箱保藏的菌株转接至综合PDA平板上，培养48 h备用。用直径为6 mm的打孔器将准备好的菌落平板制备成菌苔。将各培养基制备成平板并做好标记，用移植针将菌苔转接至平板中央，在进行温度试验时，分别将各处理放入15、20、25、30、35、40 ℃培养箱中，在进行其他处理时，将平板置于30 ℃恒温培养箱中进行倒置培养。定期观察并使用游标卡尺测量，采用十字交叉法测定菌落的直径。

1.8 菌株产孢培养工艺的研究

在菌株生物学特性研究的基础上，以香菇菌糠、黑木耳菌糠为主要培养基质，以木霉分生孢子产生量作为检测指标，测定外源氮、水分及pH值对木霉菌丝生长及产孢的影响。在试验设计中结合生产的可操作性，作如下设计：（1）料水比试验。A1处理添加100%香菇菌糠，料液比为1 g ∶ 1.5 mL;A2处理添加100%香菇菌糠，料液比为1 g ∶ 2 mL;A3处理添加100%香菇菌糠，料液比为1 g ∶ 2.5 mL;A4处理添加100%香菇菌糠，料液比为1 g ∶ 3.0 mL。（2）pH值试验。B1处理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl调节pH值至4.0，料液比为1 g ∶ 2.5 mL;B2处理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl调节pH值至4.5，料液比为1 g ∶ 2.5 mL;B3处理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH调节pH值至5.0，料液比为1 g ∶ 2.5 mL，B4处理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH调节pH值至6.0，料液比为 1 g ∶ 2.5 mL。（3）氮源试验。C1处理添加97%香菇菌糠、3%尿素，pH值自然;C2处理添加97%香菇菌糠、3%硫酸铵，pH值自然;C3处理添加97%香菇菌糠、3%磷酸铵，pH值自然。（4）黑木耳菌糠试验。D1处理添加100%黑木耳菌糠，pH值自然;D2处理添加100%黑木耳菌糠，用1 mol/L HCl调节pH值至4.5;D3处理添加97%黑木耳菌糠、3%尿素，pH值自然。

将上述各处理三角瓶于30 ℃恒温培养7 d，定期观察菌丝生长及产孢情况，培养7 d时将物料取出，自然风干后备用。采用奥立龙STAR-A211测定各培养料初始pH值及风干样品10倍液的pH值，并在马丁氏培养基上采用稀释涂平板法测定各样品的分生孢子数，在进行样品稀释时，用灭菌擦镜纸过滤孢子悬浮液以除去木霉菌菌絲。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与筛选结果

木霉感染食用菌菌棒后期会产生大量绿色分生孢子，较容易鉴别，从12棒香菇染菌棒、5棒黑木耳染菌棒上共分离到19株木霉，以香菇菌糠作为唯一营养源，测定各菌株在含10%香菇菌糠平板上的生长速度。由表1可知，木霉菌菌株在香菇菌糠培养基上的生长速度存在差异，但均可良好生长;相比较而言，菌株X-05、X-08、M-03的生长速度较快。采用血球计数板镜检法对3株木霉的产孢能力进行初步测定，由表2可以看出，3株木霉均具有较强的产孢能力，28 ℃培养120 h时，产孢量可达109～1010CFU/皿。

由表3、图1和图2可以看出，3株木霉对供试2株病原菌均具有较好的重寄生作用， 接种 2 d 后木霉菌与病原菌菌丝接触，随后病原菌受木霉拮抗而停止生长，木霉继续向病原菌菌落上生长、产孢，最后覆盖整个菌落。通过比较可以看出，菌株X-05对供试2株病原菌的拮抗效果最好，与其对峙培养的病菌菌落直径小，并且产孢略早。

2.2 菌株X-05的形态学鉴定结果

菌株X-05在综合PDA平板上生长较快，在生长初期菌落为白色，培养72 h后开始变稀疏并产孢，后期因产生大量分生孢子而使菌落呈深绿色，产孢后常出现同心轮纹状。菌落背面初期无色，后期略呈浅黄色。菌丝透明，直径为1.8～3.2 μm，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分支多，对生或互生2～3级分支;分支与分生孢子梗间近似呈直角，末端为小梗，小梗呈瓶形，顶部缢缩，分生孢子无色，球形或椭圆形，大小为（2.2～2.9） μm×（2.4～3.5） μm，分生孢子常在孢子梗顶端聚集成团状（图3）。参照魏景超的《真菌鉴定手册》和Gams、Bissett的分类系统检索表，鉴定菌株X-05为绿木霉（Trichoderma viride Pers.ex Fr.）。

2.3 菌株的生物学特性研究

2.2.1 温度对菌株X-05菌丝生长的影响 由表4可以看出，菌株X-05在15～40 ℃范围内均可生长，温度对其生长的影响显著，最适生长温度范围为25～30 ℃;当温度低于20 ℃时或高于35 ℃时，菌丝生长缓慢。

2.2.2 pH值对菌株X-05菌丝生长的影响 结合菌糠初始pH值及生产上的可操作性，测定pH值为3～8对菌株X-05菌丝生长的影响。由表5可以看出，菌株X-05菌丝在供试pH值条件下均生长良好，其中酸性环境更适于木霉菌菌丝的生长与产孢，最适pH值为4～5。

2.4 菌株X-05产孢培养工艺研究

以香菇菌糠、黑木耳菌糠作为培养基质，研究料液比、外加氮源及pH值对木霉菌丝生长及产孢的影响。由表6可以看出，当料液比为1 g ∶ 2.5 mL时，培养料含水量适宜，表层不易失水，三角瓶底部无积水，木霉菌丝生长旺盛，培养料的产孢量更大，原因可能是培养时间长时，料液比过低易导致表层失水干燥，而含水量过高易造成瓶底积水，出现染菌。外加氮源对木霉菌菌丝生长有促进作用，其中添加尿素、硫酸铵的效果明显优于添加磷酸铵的效果。试验结果表明，初始pH值对木霉菌菌丝生长及产孢具有明显影响，当培养料的初始pH值为 4.0～5.0时，木霉菌菌丝生长更旺盛，产孢时间早，产孢量大。

3 结论与讨论

木霉是食用菌生产中比较常见的杂菌，严重危害了食用菌生产。从另一个角度看，木霉是生物防治土传病害的主力军，特别是对于设施蔬菜生产而言，常年大量使用化肥农药而导致的不良后果已经受到人们的关注，生物防治理念及其相关产品的推广应用将成为热点。在实际生产中，有机肥的销售半径受限，受经济收益的限制，很多菌糠利用技术尚未得到有效应用，因此在菌糠利用时，应尽可能考虑就近消化利用。针对县域种植业、养殖业和食用菌产业的特点，拟探索适合区域应用的菌糠利用模式，构建农业废弃物循环经济模式。喀左县的食用菌产业以香菇和黑木耳为主，设施蔬菜生产以黄瓜、辣椒、茄子、番茄等为主。近年来，随着种植年限的延长，土传病害问题日益凸显，本研究以喀左县主栽食用菌香菇、黑木耳菌糠为基础，筛选得到一株既可以在菌糠上良好产孢又兼具生防效果的木霉菌株。模拟培养试验结果表明，菌糠粉碎后，在尿素添加量为3%、料液比为1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值为4.5～5.0、30 ℃条件下培养7 d，产孢量可达3.67×109～7.00×109 CFU/g，符合农用微生物制剂菌数高于0.5亿/g的产品要求，具有较好的应用前景。但应注意的是，香菇、黑木耳菌糠及木霉培养物的pH值均为酸性，直接施用于土壤存在使土壤酸化的风险，其使用方法及施用量还需要深入研究。

参考文献：

[1]杨和川，谭一罗，苏文英，等. 食用菌菌糠资源化利用研究进展[J]. 农业工程，2018（10）：54-58.

[2]李亚娇，孙国琴，郭九峰，等. 食用菌菌糠利用的最新研究进展[J]. 中国食用菌，2017，36（4）：1-4.

[3]卫智涛，周国英，胡清秀. 食用菌菌渣利用研究现状[J]. 中国食用菌，2010（5）：3-6.

[4]陈云芳，高 渊. 木霉菌在植物病害生物防治中的应用[J].江苏农业科学，2008（5）：123-125.

[5]田连生，王伟华，石万龙. 利用木霉防治大棚草莓灰霉病[J]. 植物保护，2000（2）：47.

[6]宋 漳，陈 辉. 绿色木霉对土传病原真菌的体外拮抗作用[J]. 福建林学院学报，2002（3）：219-222.

[7]彭可为，李 婵. 木霉菌的生物防治研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（2）：780-782.

[8]惠有为，孙 勇，潘亚妮. 木霉在植物真菌病害防治上的作用[J]. 西北农业学报，2003，12（3）：96-99.

[9]方中達. 植病研究法[M]. 北京：中国农业出版社，1998：122-520.

[10]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：132-493.

[11]张广志，杨合同，文成敬. 木霉菌形态学分类检索与分子生物学鉴定[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），2011，42（2）：309-316. 傅科鹤，范莉莉，陈慧颖，等. 高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化[J]. 江苏农业科学，2021，49（3）：214-218.