关靖 王皓 周俊 刘旭

恶性肿瘤是造成死亡的最主要原因，肺癌作为恶性肿瘤之一，其发病率高达17%，是目前发病率第一的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康[1-2]。目前，肺癌的治疗方法除了传统的手术治疗外，还有化疗和放疗，但肿瘤化疗耐药、放疗敏感性降低、肿瘤复发、肿瘤转移等问题一直阻碍着肺癌的临床治疗[3-5]，所以急需探究更多的肿瘤发生发展机制，寻找新型的肿瘤诊断和治疗靶点。

外泌体是由多种活细胞分泌的粒径在30～100 nm之间的纳米级囊泡，可在体液中稳定存在而发挥细胞间信息传递的作用。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分，可调控肿瘤的生长和转移，其中肿瘤相关成纤维细胞外泌体，已经被研究在肝癌和胶质瘤中发挥重要的调控作用，然而其在肺癌中尚无研究，所以本文主要探究了肿瘤相关成纤维细胞外泌体对肺癌细胞的生长和转移的作用，旨在为肺癌的临床治疗和研究提供帮助。

资料与方法

一、材料

人肺癌细胞A549(中国科学院上海细胞库)；收集20例肺癌患者的组织样本(经我院伦理委员会批准，患者签署知情同意书)，Transwell小室(福麦斯生物技术有限公司)；CCK8试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(沈阳万类生物技术有限公司)；α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗、IgG二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。

二、细胞分离与培养

肺癌细胞的培养：取液氮保存的肺癌细胞A549，于37 ℃水浴锅中迅速解冻，然后接种于100 mm2的细胞培养皿中，于细胞培养箱中培养，细胞生长至汇合率达80%时，加入胰蛋白酶消化，进行细胞传代。

原代成纤维细胞和肿瘤相关成纤维细胞的分离：从手术室取出肺癌组织和癌旁组织，用无菌的PBS溶液冲洗3次，然后在超净工作台中，将组织样本剪碎，用胶原酶、中性蛋白酶、透明质酸酶的混合溶液消化30～50 min，1 500 rpm离心5 min，组织沉淀用少量12% FBS的DMEM/F12完全培养基重悬，并接种于细胞培养皿中，培养3天后更换培养基，洗掉组织碎片和没有贴壁的细胞。培养通过胰蛋白酶消化的方法除去上皮细胞，留下成纤维细胞。

三、Western blot

消化各组细胞1×107个消化于离心管中，使用RIPA蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，然后加入上样缓冲液沸水浴30 min，使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h，然后以1 ∶1 000比例稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应半分钟，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

四、NFs和CAFs鉴定

Western blot和免疫荧光检测NFs和CAFs中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表达，免疫荧光主要步骤为：将细胞接种至激光共聚焦皿中，使用4%的甲醛溶液固定，然后加入血清封闭2 h，加入适量α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin一抗，37 ℃孵育1 h；然后用PBS 漂洗，以洗去多余抗体，然后加入适量浓度的带有CY3标记的二抗溶液，37 ℃室温孵育1 h，然后使用DAPI染细胞核，然后于激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达。

五、外泌体的提取与鉴定

使用差速离心法提取细胞培养上清中的外泌体，首先将细胞培养基更换为含10%无外泌体胎牛血清的完全培养基，培养48 h后收集细胞培养上清，将上清液3 000×g，4 ℃离心15 min去除死细胞；然后将上清液6 000×g离心40 min，去除细胞碎片；10 000×g离心1 h，取上清；100 000×g离心1 h，收集沉淀即为外泌体，用400 μl PBS重悬外泌体，并放在-80 ℃保存。

外泌体的鉴定：于透射电镜下观察外泌体的结构特征，Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101。

六、CCK8实验

CCK8实验检测细胞增殖能力，用含无外泌体胎牛血清的DMEM完全培养基将A549细胞稀释至1×105个/mL，96孔板中每孔接种100 μl上述细胞，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，每组5个复孔，并设置24、48、72 h时间点的96孔板，然后将上述96孔板于细胞培养箱中培养，在各时间点取出96孔板，每孔加入10 μl CCK8溶液，37 ℃条件下孵育4 h，然后使用酶标仪在450 nm波长条件下检测各空光密度值(OD值)。

七、细胞迁移实验

使用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释A549细胞，细胞细胞接种至Transwell小室中，每孔1×104个/200 μl细胞，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培养基，然后将24孔板置于细胞培养箱中24 h，Transwell小室底部用结晶紫染色10 min，然后在显微镜下观察并拍照，比较各组细胞迁移数。

八、细胞侵袭实验

用Transwell小室法检测细胞侵袭能力，主要过程为：将Matrigel胶4 ℃融化后，取20 μl平铺于Transwell小室中然后置于37 ℃培养箱中凝固1 h，用DMEM空白培养基重悬A549细胞，细胞接种至Transwell小室中，每孔1×104个200 μl细胞，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培养基，然后将24孔板置于细胞培养箱中24 h，Transwell小室底部用结晶紫染色10 min，然后在显微镜下观察并拍照，比较各组细胞侵袭数。

九、细胞凋亡实验

将A549细胞与各组外泌体共孵育24 h后，根据细胞凋亡检测试剂盒，取5×105个细胞于离心管中，用500 μl的Binding Buffer重悬细胞成单细胞悬液，而后添加5 μl的Annexin V-FLTC和5 μl的PI染料，混匀后室温避光孵育15 min，并设置Annexin V-FLTC和PI单阳性管用于调荧光补偿，空白管用于调电压；使用流式细胞仪检测上述各样品的荧光值，使用FlowJo v5.573软件分析细胞凋亡数。

十、统计学分析

结 果

一、肿瘤相关成纤维细胞的鉴定

免疫荧光检测和Western blot检测α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表达结果(见图1、2)，所提取的CAFs表达α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，而NFs细胞中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表达较弱，符合CAFs和NFs的特征，说明所提取的CAFs和NFs可用于后续研究。

二、外泌体鉴定结果

透射电镜观察外泌体结果(见图3)显示，所提取的外泌体粒径在30～100nm之间，具有双层膜结构，形态呈“杯托”样，符合外泌体的结构特征，Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101(见图4)。所提取的外泌体表达CD9、CD63、TSG101，符合外泌体的生物学特征。

图1 免疫荧光鉴定CAFs和NFs结果(×20)

图2 Western blot鉴定CAFs和NFs细胞α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表达

图3 透射电镜观察外泌体形态结构

图4 Western blot检测外泌体CD9、CD63、TSG101表达

三、CAFs外泌体促进肺癌细胞增殖

为了探究CAFs外泌体对A549细胞增殖能力的影响，将PBS、NFs exo、CAFs exo与A549细胞共孵育，CCK8法检测细胞增殖能力的变化，结果(见图5)，相比于PBS组，NFs exo组A549细胞增殖能力无显著差异，CAFs exo组A549细胞增殖能力显著增加(P<0.001)，说明CAFs外泌体能够显著促进肺癌细胞的增殖。

四、CAFs外泌体促进肺癌细胞迁移

Transwell小室法检测细胞迁移结果(见图6)显示。相比于PBS组，NFs exo组A549细胞迁移能力无显著变化(P>0.05)，而与CAFs exo共孵育后A549细胞迁移能力显著增加(P<0.001)，提示肿瘤相关成纤维细胞外泌体能够显著促进肺癌细胞的迁移能力。

图5 CCK8法检测外泌体对A549细胞增殖能力的影响 (与PBS组相比，***P<0.001)

五、CAFs外泌体促进肺癌细胞侵袭

Transwell小室法检测肿瘤相关成纤维细胞外泌体对A549细胞的影响，检测结果(见图7)。与NFs exo共孵育后，A549细胞侵袭能力无显著变化(P>0.05)，与CAFs exo共孵育后A549细胞侵袭能力显著增加(P<0.001)，说明肿瘤相关成纤维细胞外泌体能够显著促进肺癌细胞的侵袭能力。

六、CAFs外泌体抑制肺癌细胞凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡结果(见图8)显示，与NFs外泌体共孵育后A549细胞凋亡水平与PBS组相比无显著变化(P>0.05)，与CAFs外泌体共孵育后，A549细胞凋亡水平显著低于PBS组(P<0.001)，说明肿瘤相关成纤维细胞外泌体能够抑制肺癌细胞凋亡。

图6 细胞迁移实验检测外泌体对A549对细胞迁移能力的影响(与PBS组相比，***P<0.001)(×20)

图7 细胞侵袭实验检测外泌体对A549细胞侵袭能力的影响(与PBS组相比，***P<0.001)(×20)

图8 流式细胞术检测外泌体对各组细胞凋亡水平的影响(与PBS组相比，***P<0.001)

七、CAFs外泌体激活PI3K/AKT/mTOR信号通路

Western blot检测外泌体对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，结果如图9所示，相比于PBS组，NFs exo组A549细胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平无显著差异(P>0.05)，CAFs exo组A549细胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平显著增加(P<0.001)，说明CAFs外泌体可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路而促进肺癌细胞的生长和转移。

图9 Western blot检测外泌体对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响(与PBS组相比，***P<0.001)

讨 论

CAFs是肺癌肿瘤微环境的的重要基质细胞之一[6]，可通过旁分泌在肿瘤的生长、转移、血管新生、免疫逃逸、肿瘤耐药中发挥重要的调控作用[7-8]，CAFs可重塑细胞外基质结构以及肿瘤微环境而调控肿瘤的发生发展[9]。肿瘤微环境中的多种基质细胞均可通过分泌外泌体，局部或全身性的参与细胞间的信息传递，CAFs和肿瘤细胞之间也可通过外泌体进行信息交流，进而影响肿瘤的发生发展[10-11]。如食管癌CAFs可以通过分泌外泌体而调控食管癌细胞的粘附、细胞内吞以及细胞连接等[12]。在胰腺癌中，CAFs外泌体可调控胰腺癌的增殖和吉西他滨的耐药[13]。然而CAFs外泌体对肺癌的影响尚无报道，所以本文将研究定位于肺癌中CAFs分泌的外泌体对肺癌细胞生长和转移的研究，旨在发现肿瘤微环境调控肺癌的新机制。

本研究首先分别从肺癌组织和癌旁组织中提取分离了纤维细胞，然后利用免疫荧光和Western blot鉴定了CAFs中高表达α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，说明肺癌组织中的成纤维细胞为肿瘤相关成纤维细胞，为了探究CAFs外泌体的功能，体外培养CAFs和NFs后收集细胞培养上清，提取并鉴定外泌体后将外泌体与肺癌细胞A549细胞共孵育，检测外泌体对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞凋亡的影响，结果显示，CAFs细胞所分泌的外泌体能够显著促进A549细胞增殖、迁移和侵袭能力，降低A549细胞的凋亡水平，而NFs外泌体对A549细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡则无显著影响，说明CAFs外泌体能够调控肺癌细胞的生长和转移能力。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是肿瘤研究中的经典信号通路[14-15]，已经被证明可在多种肿瘤中异常激活，该通路的异常激活可引起肿瘤的异常转化、促进肿瘤的生长和转移，影响肿瘤血管新生等，在肿瘤的临床治疗中该通路的关键因子的活化还可作为评价患者预后的指标[16-17]，已有研究表明，非小细胞肺癌中PI3K、AKT、mTOR基因表达均上调[18-20]。本研究发现，CAFs外泌体与A549细胞共孵育后，A549细胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平均显著增加，即PI3K/AKT/mTOR信号通路激活，而NFs外泌体则对该通路无显著影响，说明肿瘤相关成纤维细胞能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路而促进肺癌的生长和转移。

综上所述，在肺癌中，肿瘤相关成纤维细胞分泌的外泌体能够促进肺癌的生长及转移，其机制为激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，但是外泌体中何种物质发挥的调控功能，还需进一步研究。