徐 冰，角 加，聂 波

（1.中国藏学研究中心北京藏医院 中医科，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院/中医内科学教育部暨北京市重点实验室，北京 100700）

缺血性心脏病对人类健康造成严重危害，在治疗缺血性心脏病的过程中，缺血后再灌注反而使原缺血区组织损伤加重。研究心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的机制并寻求抗MIRI 有效药物和方法尤为重要[1-2]。藏药八味沉香散临床观察对冠心病心绞痛效果显著，是治疗心血管疾病常用藏药之一。本研究以大鼠心肌细胞H9C2 为靶细胞，探讨八味沉香散对缺血再灌注损伤心肌细胞中SOD 活性、MDA 水平以及细胞凋亡的影响，研究其保护心肌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 大鼠心肌细胞H9C2（购自中国科学院细胞库，货号GNR 5）。

1.2 主要试剂 完全培养基（ECM）的配置：含10%特级胎牛血清（杭州四季青，货号13011-8611），90%高糖DMEM（货号12100）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（货号T1300），PBS 磷酸盐缓冲液（货号P1010），细胞级DMSO（货号8371），均购自北京索莱宝科技有限公司；有糖Earles 液（货号CC0042），无糖Earles 液（货号X0942），均购自Leagene。超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（货号A001-3）、细胞丙二醛（MDA）测试盒（货号A003-4），均购自南京建成生物工程研究所；八味沉香散（西藏神猴药业）；曲美他嗪（HY-B0968），购自MCE 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号P0012），细胞凋亡－Hoechst染色试剂盒（货号C0003），均购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 倒置相差显微镜（Olympus IMT-2）、徕卡倒置荧光显微镜（DM IL LED）、CO2培养箱（MCO-20AIC，SANYO 公司）、低氧CO2培养箱（MiniGalaxy A，RS biotech 公司）、超净工作台（ESCO公司）、台式灭菌器（T4 0R3250）、纯水机（GN-RO-40）、电热恒温水箱（HH.W21.420）、低速离心机（LD4-2）、全自动酶标仪（Clinic bio 128C）。

1.4 实验方法

1.4.1 复制缺血再灌注体外模型 H9C2 细胞正常培养：将H9C2 细胞悬液以每平方厘米8 000 个接种至培养瓶中，CO2培养箱（95%空气，5%CO2）中贴壁培养，第2 天更换ECM 以去除残留的DMSO 和未贴壁的细胞，隔2 天换液1 次。至细胞大约90%融合时传代，以PBS 漂洗2 遍，按40 μL/cm2加入0.25%胰酶消化液，约1 min 后镜下观察细胞变圆，震动瓶壁至细胞脱落，按1:2 体积立即加入ECM 终止消化，收集细胞混悬液，1 000 rpm 离心5 min，弃液，将细胞团重新混悬，细胞计数，以104个/孔种入96 孔板正常培养，待细胞85%融合时造模。分组造模：以缺糖缺氧模拟缺血，复糖复氧模拟再灌注。设正常组、缺氧2 h、4 h、6 h 组，每组设6 个复孔。正常组，缺氧时用有糖Earles 液，再灌时换ECM，始终在正常条件下培养。模型组，缺氧时用无糖Earles 液，低氧CO2培养箱（37℃，5%CO2，1%O2）中分别培养2 h、4 h、6 h，再用ECM 在CO2培养箱正常培养24 h。造模结束以cck8 法检测各组细胞增殖情况，每孔加CCK8 10 μL 和ECM 100 μL，37 ℃孵育1 h，酶标仪测定450 nm 各孔吸光度（OD）值。

1.4.2 八味沉香散提取物（水提）对心肌细胞SOD、MDA 水平的影响 将细胞以2.5×104/cm2接种于60 mm培养皿中，待细胞85%汇合时造模，方法同1.4.1。实验分组：正常组，有糖Earles 液培养4 h，更换ECM培养24 h，均在CO2培养箱中培养；缺血再灌注组（I/R 组），低CO2培养箱中以无糖Earles 液培养4 h，更换ECM 于CO2培养箱中培养24 h；I/R ＋八味沉香散提取物（水提）高、中、低剂量组，在造模前1 h及I/R 时加入相应浓度（240、120、60 ug/mL）的八味沉香散提取物；D.曲美他嗪对照组：在造模前1 h 及I/R 时加入240 ug/mL 的曲美他嗪。

造模结束后，胰酶消化收集细胞团于ep 管中。1）细胞破碎：加1 mL PBS 混匀，1 000 r/min 离心10 min，留细胞沉淀，再加0.5 mL PBS，以冰水浴超声破碎，每5 s 超1 次，间隔4 次，每次间隔30 s。2）蛋白浓度测定：加入按梯度稀释的标准品、等体积样品于96孔板中，每个样本和标准品均设复孔，各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃ 20 min，测定562 nm 的吸光度，根据标准曲线和使用的样品体积计算蛋白浓度。3）测定SOD 活力：设对照孔（20 μL 蒸馏水+20 μL酶工作液）、对照空白孔（20 μL 蒸馏水+20 μL 酶稀释液）、测定孔（20 μL 样本+20 μL 酶工作液）、测定空白孔（20 μL 样本+20 μL 酶稀释液），各孔均加入底物应用液200 μL，混匀，37℃孵育20 min，测定A450 值。SOD 抑制率（%）=[（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）]/（A对照-A对照空白）×100%，SOD活力（U/mgprot）=SOD 抑制率/50%×（反应体系/稀释倍数）/待测样本蛋白浓度（mgprot/mL）。4）测定MDA 含量：造模结束后，于细胞团加0.5 mL 提取液，冰水浴超声破碎成悬液样本。设空白管（无水乙醇）、标准管（10 nmol/mL 标准品）、样品管各取100 μL 均加入1 mL MDA 工作液，混匀，95℃水浴40 min，流水冷却，4 000 r/min 离心10 min，取250 μL 反应液加入96 孔板中，530 nm 测吸光度。MDA含量（nmol/mgprot）=（OD测定-OD空白）/（OD标准-OD空白）×标准品浓度（10 nmol/mL）/样本蛋白浓度（mgprot/mL）。

1.4.3 八味沉香散提取物（水提）对心肌凋亡的影响 取洁净盖玻片在75%乙醇中浸泡5 min，无菌PBS 洗涤3 遍，再用ECM 洗涤1 遍，将盖玻片置于24 孔板内，按2.5×104/cm2接种细胞，约为80%满时造模。实验分组及造模方法同1.4.2。实验结束后，吸尽培养液，加入0.5 mL 固定液，固定10 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。加0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。滴1 滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光显微镜激发波长350 nm，发射波长460 nm 观察照相。

1.5 统计学方法 半定量结果用image J 软件对图象进行灰度分析。数据以均数±标准差（）表示，用SPSS 17.0 统计软件进行分析。组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），最小显著差法（LSD）进行两两比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H9C2 缺血再灌注损伤模型构造 细胞形态特征变化：倒置显微镜下观察正常组细胞呈多个小岛样克隆，胞体肥厚、透明，菱形或多角形，略长，核小而圆，呈铺路石样，展开贴壁，形态无明显改变。体外模拟缺血，2 h 后模型组细胞稍有回缩，4 h 后模型组大量细胞回缩变瘦长，间隙变大，部分漂浮，折光性增强，6 h 后模型组细胞大部分漂浮，细胞成膜状脱落，细胞破裂，细胞膜完整性破坏。如图1。缺血再灌注模型细胞增殖活性：不同时间缺氧再灌注对H9C2 细胞增殖活性OD 值，正常组（1.28±0.10），缺氧2 h 组（1.07±0.15），缺氧4 h 组（0.64±0.12），缺氧6 h组（0.37±0.38），可见体外模拟缺糖缺氧2 h、4 h、6 h 再灌注24 h 的各模型组体现细胞增殖活性的OD 值均低于正常组（P＜0.01）。说明缺血2 h 时，细胞已出现损伤，随缺氧时间延长，OD值下降，活细胞数减少，在6 h 细胞破损严重。故选取4 h 缺氧24 h 再灌注造模。

图1 H9C2 不同时间缺血再灌注损伤模型（X100）

2.2 各组H9C2 细胞SOD 活力和MDA 浓度比较 见表1。

表1 各组H9C2细胞SOD活力和MDA浓度比较（，n=6）

表1 各组H9C2细胞SOD活力和MDA浓度比较（，n=6）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，# # P ＜0.01；与正常组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.3 八味沉香散提取物（水提）对心肌凋亡影响 荧光镜下观察：细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst 33258 染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核颜色偏淡，细胞核体积较大，形状较均一，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色发白，细胞核体积较小，形状不均一，大小不等。正常组有极少量细胞核致密浓染，模型组有大量致密或碎块状的浓染细胞核，曲美他嗪组和八味沉香散各剂量组浓染细胞核较缺氧组明显减少。见图2。半定量图像分析：模型组平均光密度明显增高，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，曲美他嗪和八味沉香散的平均光密度显著低于模型组（P＜0.01），表明八味沉香散能够很好抑制MIRI 损伤造成的细胞凋亡，且药效随浓度升高增强。见表2。

图2 各组H9C2 细胞凋亡荧光染色

表2 各组H9C2 细胞凋亡水平阳性表达面积、光密度和平均光密度表（，n=6）

表2 各组H9C2 细胞凋亡水平阳性表达面积、光密度和平均光密度表（，n=6）

注：与模型组比较，# # P ＜0.01；与正常组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3 讨论

MIRI 导致大量活性氧自由基生成已被研究证实[3-4]。活性氧自由基所致的氧化损伤可以导致很多疾病的发生，而抗氧化防御系统是保护机体免受损害的重要屏障[,5-6]。研究表明，正常机体内的氧化/抗氧化系统处于动态平衡状态，过剩的活性氧自由基被机体正常的抗氧化防御系统清除；在受到MIRI 刺激后，线粒体电子传递链可以释放出大量活性氧自由基，机体清除力不足，使氧化/抗氧化系统的平衡状态被打破，引发氧化应激反应[7-8]。活性氧自由基可以与细胞膜的不饱和脂肪酸和胆固醇结合，发生脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物（MDA），使细胞膜流动性下降而通透性增高，能间接反应自由基对机体的损伤程度[9-10]。SOD 是体内氧自由基清除系统的主要酶，除此外还有过氧化氢酶（GSHPx）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、维生素C、维生素E 等，SOD 可以催化O2-歧化反应，生成氧化活性相对较弱的H2O2，并继续在过氧化氢酶和GSHPx 的催化下转化成水，其水平的高低可反映机体清除自由基的能力[11-12]；两者常共同检测以评价机体抗氧化能力/氧化损伤程度[13]。活性氧自由基诱发细胞凋亡的途径主要有2 种：1）直接诱导细胞凋亡。细胞膜的脂质过氧化反应，使蛋白质肽键断裂，受体蛋白酶、通道蛋白等膜蛋白分布紊乱，诱导细胞凋亡[14]；产生的脂质过氧化物和OH 也能直接损伤DNA，影响DNA 的稳定，使DNA 断裂，导致细胞凋亡[15-16]；2）间接诱导细胞凋亡。活性氧通过影响线粒体呼吸链、细胞内的钙离子等，影响信号转导与基因表达，诱发细胞凋亡[17]。

本研究中，缺氧再灌注损伤后大鼠心肌细胞的MDA 浓度明显升高，SOD 活力降低，而八味沉香散提取物（水提）能有效抑制MIRI 造成的MDA 浓度升高，使SOD 活力保持在较高水平，减轻细胞的氧化损伤。本研究通过细胞实验证明，缺氧再灌注损伤使心肌细胞的凋亡水平明显增加，八味沉香散提取物（水提）能够明显抑制MIRI 造成的细胞凋亡。综合实验结果，推测八味沉香散的抗缺氧再灌注损伤作用，是通过减少应激状态下活性氧化自由基的形成，减少脂质过氧化物生成，提高抗氧化能力如SOD 活力，阻断由其诱发的细胞凋亡的直接和间接途径，达到保护心肌细胞作用的。

藏药八味沉香散记载于《四部医典》中，由沉香、肉豆蔻、广枣、石灰华、木棉花、乳香、木香和诃子等8 味藏药组成，具有养心安神、理气开窍、行气活血等功效。本研究显示，八味沉香散能够通过提高心肌细胞的抗氧化能力，减少缺血再灌注损伤氧化物的生成，抑制细胞凋亡，保护心肌细胞，为藏医独特组方理论、藏药高抗缺氧作用提供了切实的实验依据，具有广阔的应用前景和社会价值。