王希江 谭云洪 贺文从 欧喜超 刘东鑫 赵雁林

耐药结核病的广泛流行是结核病有效防控的巨大挑战。WHO[1]报告显示，2019年全球约50万例利福平耐药(rifampicin resistance tuberculosis, RR-TB)新发结核病患者，其中78%为耐多药结核病(multidrug-resistance tuberculosis，MDR-TB)患者。据估计，在这部分患者中，仅51%的患者被检测发现，30%的患者获得治疗，治疗成功率为56%[1]，这在很大程度上导致了RR/MDR-TB的传播和流行。目前，结核病的防控主要依赖于快速诊断和有效治疗，尤其是对耐药性的及时正确诊断是确定有效治疗方案、提高治愈率，进而阻断传播的基础。表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)价格昂贵、耗时较长，且对设备要求较高。目前包括GeneXpert®(Cepheid, USA)、GenoType MTBDR plus V2 (Hain Life science GmbH, Nehren, DE)及AID TB Resistance Line Probe Assay (AID GmbH, Strassberg, DE)等的一系列分子生物学检测方法，虽然可以实现快速检测，但仅针对某些特定的耐药基因，无法识别全部的耐药突变位点。全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)基于整个4.4 Mb 结核分枝杆菌基因组进行检测，在提供全面的耐药突变位点同时，还可识别异质性耐药，很大程度上弥补了靶向分子方法的缺陷。

利福平(RFP)和异烟肼(INH)作为治疗结核病的基石，其耐药突变位点多样性已有报道[2-3]，进一步研究表明不同的突变位点及突变方向可能导致结核分枝杆菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)不同，而不同的MIC值可能会引起治疗效果的差异。因此，本研究以新疆维吾尔自治区(简称“新疆”)和湖南省国家耐药监测点的菌株为例，采用WGS全面了解RFP及INH耐药菌株分子特征的同时，将反映耐药水平高低的MIC值与耐药突变位点相结合，探究耐药突变基因型与耐药水平的量化关系，以期为我国相关分子生物学诊断方法的研发和临床用药方案及剂量的确定提供依据。

资料和方法

一、 菌株来源

2016—2017年新疆(柯坪县、岳普湖县和疏勒县)和湖南(怀化市、永顺县、祁东县、桃江县和耒阳市)国家耐药监测点的所有痰涂片阳性肺结核患者的痰标本进行分离培养，获得阳性培养物。最终获得785株结核分枝杆菌，新疆193株，湖南592株。

二、 实验方法

(一)菌株培养

将含有菌液的冻存管放置37 ℃恒温培养箱中复苏。吸取0.1～0.15 ml菌液均匀接种于培养管的罗氏培养基上，每株菌接种2支培养管。将培养管放置37 ℃恒温培养箱中孵育。具体操作参考《结核病实验室检验规程》[4]。培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

(二)药敏试验

药敏试验采用TREK Sensititre®MYCOTBI药敏板(美国 Thermo公司)，测定结核分枝杆菌对RFP和INH两种抗结核药物的MIC[5-7]。利福平和异烟肼均按倍比含量以冻干粉的形式固着于微孔板上，药物浓度分别为0.12～16 μg/ml和0.03～4 μg/ml。操作过程按照生产企业操作手册进行。采用超声磨菌仪(体必康生物科技有限公司)制备0.5麦氏单位的菌悬液，取100 μl制备好的菌悬液加至10 ml的Middlebrook 7H9肉汤培养基(OADC生长添加剂浓度为10%)中，混匀后，通过SensititreTM接种仪(Thermo Fisher, Scientific Inc., USA)接种，每孔100 μl。接种完成后，用黏性贴膜将药敏板密封，置于37 ℃含5% CO2的恒温培养箱中培养14 d，由VizionTM数字观察系统辅助读板。MIC定义为与阳性对照孔相比较没有明显可见的细菌菌落生长的最低浓度。

药敏试验均采用结核分枝杆菌标准株H37Rv (ATCC 27294)作为药物敏感菌株对照。每块药敏板含有两个阳性对照孔(不含抗结核药物)，如果两个阳性对照孔中均存在可见的或可接受的细菌生长，且该药对应的孔中没有污染、蒸发和跳孔现象时，则MIC结果认为是可读且有效的。由2名实验员分别通过VizionTM数字观察系统读取结果，并对结果进行复核，不一致的结果进行重新读取。

临界值浓度参考CLSI MA-24，INH临界浓度为0.2 μg/ml，RFP临界浓度为1 μg/ml,菌株的MIC值>临界值，则结核分枝杆菌对该药耐药，如果MIC值≤临界值，则为敏感。788株结核分枝杆菌，3株因药敏试验结果无效而被排除，最终785株结核分枝杆菌获得有效的药敏试验结果。

(三)全基因组测序及耐药预测

785株结核分枝杆菌经药敏试验判定为RFP和(或)INH耐药124株，对124株菌采用CTAB/NaCl法提取其全基因组。利用Nanodrop ND-1000核酸分析仪测定核酸样本的浓度及纯度，保证样本满足光密度260/280=1.8～2.0，光密度260/230=2.0～2.2，浓度>50 ng/μl。合格样本由中国科学院微生物所利用Illumina公司的NextSeq500测序仪，使用2×150 bp双端测序对结核分枝杆菌DNA完成测序。

(四)生物信息学分析

124株结核分枝杆菌完成测序后使用Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore)及FastQC对原始FASTQ序列进行过滤。选取Reads平均深度超过60 ×(“×”指测序深度)，覆盖度超过97%的样本用于后续分析。将质控合格的FASTQ测序文件上传到TB Profiler (Version 2.7.4)进行基因型耐药分析[8]。

(五)统计学处理

采用Excel 2016建立原始数据库，采用统计描述对耐药菌株的分子特征进行对比分析。

结 果

一、 表型药敏试验结果

124株检测为RFP和(或)INH耐药，包括RFP单耐药菌株13株，INH单耐药菌株50株，对两者同时耐药(MDR-TB)61株，耐多药率为7.77%(61/785)。

二、 耐药相关基因突变分布

122株RFP和INH耐药菌株获得全基因组测序数据(2株因建库失败或者质控不合格而被排除)，并纳入最终分析，包括59株MDR菌株，50株单耐INH菌株，13株单耐RFP菌株。

1. 利福平耐药相关基因突变分布：72株RFP耐药菌株中， 70株(97.22%)检测出rpoB基因耐药相关位点突变，其中98.57%(69/70)的突变出现在利福平耐药决定区(RRDR)。WGS分析共检测到23种错义突变形式，除一种突变形式(rpoBLeu430Pro)对应的表型药敏试验结果为敏感外，其他均表现为耐药(表1)。RFP耐药菌株的相关基因突变主要位于rpoB450、rpoB445以及rpoB435密码子，占81.43%(57/70)，其中rpoBSer450Leu为最常见的突变(45.71%，32/70)，其次是rpoB445密码子的多种错义突变(28.57%, 20/70)，主要包括His445Tyr(9株)、His445Leu(5株)和His445Asp(4株)。2.86%(2/70)的耐药菌株同时存在rpoC补偿性突变(表1)。耐药突变以单密码子突变为主(78.57%，55/70)，组合突变(指一株菌中出现多个耐药位点)出现的频率为21.43%(15/70)，其中以rpoB(His445Tyr+Asp435Phe)组合最为常见(5/15)(表1)。

2. 异烟肼耐药相关基因突变分布：109株INH耐药菌株中，102株(93.58%)存在耐药相关基因突变，7株(6.42%)未检测到耐药相关位点突变(表2)。TB profiler分析结果显示，共检测到18种耐药突变形式，突变涉及katG、ahpC、inhA、fabG1基因及其上游调控区域，其中以katG(81.37%，83/102)基因突变为主。85.29%(87/102)的INH耐药突变位于katG315密码子以及fabG1启动子区，其中katGSer315Thr为最常见的耐药突变(57.84%,59/102)，包括57株单基因突变和2株组合突变菌株。有8株(7.34%，8/109)INH耐药菌株在katG基因的非315密码子区发生突变。fabG1-inhA启动子区C-15T的核苷酸改变是INH耐药相关的第二大突变(16.67%,17/102)，inhA基因编码区突变频率仅为0.91%(1/109)(表2)。INH耐药突变以单基因突变为主(87.25%，89/102)，组合突变仅占11.93%(13/109)。

表1 利福平耐药相关基因突变分布情况

三、 耐药基因突变与MIC分布

比较122株RFP和INH耐药菌株的耐药基因突变与MIC的分布情况(图1)，不同的耐药基因突变导致的耐药水平的高低不同。对于RFP，rpoBS450X、rpoBH445Y、rpoBH445D、rpoBD435V及rpoBS441L突变导致的耐药为高水平耐药(MIC均≥16 μg/ml)，ropBH445L突变导致的耐药水平对应的MIC值在2～8 μg/ml之间浮动，rpoBL452P突变导致的耐药水平较低 (2 μg/ml)。大多数 (93.33%，14/15)组合突变(指一株菌出现多个耐药突变位点)导致的耐药为高水平耐药,而rpoBL430P突变菌株的MIC值仅为0.25 μg/ml,表型药敏结果为敏感株，2株野生型菌株(wild-type，wt)的MIC值>16 μg/ml，表现为高水平耐药。对于INH、katGS315T、katGS315N及ahpC(C-81T)突变引起的耐药水平较高(MIC≥2 μg/ml)，ahpC(G-48A)引起的耐药水平高低不等，MIC值跨度范围较大(0.5～4 μg/ml)。而fabG1(C-15T)突变导致的耐药水平较低，多在临界值邻近位置波动 (0.2 μg/ml)。多位点组合基因突变以及其他突变引起的耐药水平高低不等。7株野生型菌株为表型耐药菌株，其耐药水平差异较大(图1)。

讨 论

结核分枝杆菌耐药的主要机制是DNA突变[9]，使得通过检测基因突变诊断耐药性成为可能。WGS基于结核分枝杆菌全基因组(4.4 Mb)的检测分析提供了关于多态性、插入和缺失(indels)的准确信息，弥补了靶向分子检测手段的缺陷，已成为预测耐药性的有力诊断工具[10]。本研究通过采用WGS对RFP和(或)INH耐药菌株的分子特征进行全面阐述，并将耐药基因突变与MIC相结合进行分析，以明确耐药突变与耐药水平的关系，进一步丰富和完善了对RFP和INH基因型是否为耐药基因型的解释。

表2 异烟肼相关耐药基因突变分布情况

MIC是指小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度，如果在药物最高浓度的孔内仍有细菌生长则判读为>最高浓度，微孔板内利福平最高浓度为16 μg/m，异烟肼最高浓度为4 μg/ml。 不同颜色表示不同耐药位点，每个点代表一株菌株，虚线表示临界浓度值(RFP 1 μg/ml, INH 0.2 μg/ml)，为避免点过度重合，点可能在测定MIC值的上下小范围浮动。rpoB (S450X)包括:rpoB(S450L)(31株)， rpoB(S450F) (1株)，rpoB(S450W)(1株)；组合突变表示一株菌中含2种及以上的突变；RFP中其他包括rpoB (I491F)(1株)，rpoB (S441L) (2株), rpoB (L430P)(1株)，rpoB(D435Y)(3株); INH中其他包括katG (146_147insTGCA)(1株)，katG (V1A)(1株)，ahpC(C-54T)(1株)，ahpC(C-52T)(1株)，katG (A109V)(1株), ahpC(C-81T)(2株);野生型表示不存在耐药基因突变(耐异烟肼菌株7株)

本研究结果显示，WGS对RFP耐药菌株的检出率为97.22%，与Kardan-Yamchi等[11]的研究结果基本一致，其中2株RFP耐药菌株(MIC>16 μg/ml)未检测到耐药相关基因突变，重复药敏试验证实表型药敏试验结果可靠，提示可能存在如细胞壁通透性降低、药物外排泵改变等其他耐药机制[12]。大量研究表明，超过95%的RFP耐药菌株的耐药突变发生于rpoB基因长度为81bp的热点区域(编码密码子426～452位)，即利福平耐药决定区(RRDR)[13]。本研究检测到一种发生在RRDR区以外的与RFP耐药相关的罕见突变rpoBI491F[14]，此发现提示，仅以检测rpoB基因RRDR区的突变位点作为RFP耐药筛查会导致该类耐药患者的漏诊，进而可能引起携带罕见突变的菌株在该地区的扩散和流行。与以往研究结果一致，本研究发现RFP耐药相关位点突变主要出现在rpoBRRDR区的450、445及435密码子[15-16]，且最常见的突变类型为S450L(45.71%)。此外，本研究发现rpoB450密码子突变、rpoBH445Y、rpoBH445D突变与RFP高水平耐药相关，而rpoBL452P突变为低水平耐药，该结果与Jamieson等[16]研究结果吻合。值得注意的是，本研究结果显示当rpoBL452P突变菌株伴有rpoC补偿性突变(rpoCI885V)时，其耐药水平明显升高(MIC>16 μg/ml)，提示补偿性突变可能与耐药水平的积累效应有关，但由于本研究代偿性突变菌株量较少，相关结论需要进一步增加菌株量证明。目前，rpoBL430P突变与RFP耐药相关已有报道[12,17]，但WHO仍将rpoBL430P列为可信度较低的RFP耐药突变，且与低水平耐药相关[18]，本研究中WGS检测出的rpoBLeu430Pro突变菌株为表型敏感菌株(重复药敏试验证实药敏结果准确)，得出的结论与WHO的结论相似，不建议将rpoBL430P突变列为RFP耐药相关突变。

与RFP耐药机制相比，INH的耐药突变更为复杂，涉及多个基因[19]。在全球范围内，INH耐药主要与katG和inhA启动子的突变有关，尤其是katG中的密码子315和inhA启动子中的-15[20]，本研究两者组合后INH耐药菌株的检出率为85.29%。INH耐药菌株中，katG315突变的发生率存在明显的地理差异[3]，其频率从42%至90%不等[21]， Zhang等[22]针对华东5省的137株耐INH菌株的研究结果显示，katG315突变发生率为64.4%，而本研究katG315的突变率为81.37%，提示不同区域katG315突变可能存在差异，但是由于本研究样本量及区域代表性均不足，要证明katG315突变区域性差异需要进一步增加样本量及采样点。有研究表明，INH耐药菌株在katG中发现315密码子以外区域的突变频率低于1%[3]，但本研究中突变频率为7.34%，提示我国katG基因突变的多样性较高。本研究发现katG密码子315的突变表现为INH高水平耐药，而fabG1C15T突变表现为低水平耐药(MIC≤1 μg/ml)，与来自乌干达的研究报道一致[23]，但多重组合突变无明显耐药累积效应。另有研究证明，高剂量INH (16～18 mg·kg-1·d-1)可以显著缩短MDR-TB患者痰培养转阴时间及改善预后[24]，由此提示以基因型耐药量化耐药水平可以为INH剂量的选择或药物的更换提供理论依据。

研究表明细菌MIC值的高低与疾病治疗效果及复发有着密切关系，部分MIC较低的耐药菌株采用高浓度异烟肼和利福平治疗可以达到较好的治疗效果，而高浓度耐药可能达不到预期的治疗效果[25]，同样敏感菌株中MIC值较高的细菌容易导致患者复发[26]，而目前以PCR为基础的快速分子诊断技术仅能诊断细菌耐药与否，不能明确给出突变位点位置及突变方向，本研究提示不同的耐药位点与MIC值存在一定的关联性，可以为后续更为精确的快速耐药分子生物学诊断技术的研发提供理论基础。

本研究的局限性是未将纳入的菌株构建系统发育树进行分析，可能潜在的成簇菌株会影响MIC值及耐药基因的分布。尽管如此，本研究对了解我国部分地区RFP和INH耐药基因突变谱有较大贡献，同时提供了关于结核分枝杆菌耐药基因型和MIC相关的数据，为阐明基因型耐药与表型耐药的量化关系提供了线索，有利于新型诊断技术的开发和临床决策的指导。