谈小文 王媛 崔晓利 党丽云 雷静 任斐 赵国连

分子生物学检测方法因其具有检测敏感度高、特异性强和时效性高等特点，成为结核病快速诊断的重要检测手段。对于分子生物学检测，寻找检测效率高且存在特异性的靶基因尤为重要，分子检测靶基因的种属特异性和多拷贝序列是确保检测结果准确性和高效性的重要因素。结核病分子生物学病原诊断常用的诊断靶标有IS6110、16SrRNA、gryB和rpoB基因等，以上基因均属于管家基因。其中IS6110为多拷贝基因，其用于病原学诊断敏感度高于单拷贝基因，但是IS6110基因并非存在于所有结核分枝杆菌中，有的菌株IS6110基因缺失，可能造成假阴性结果[1]。本研究对西安市胸科医院收治的1例IS6110基因零拷贝菌株感染的结核病患者病原学诊断过程及分离株测序结果进行分析，旨在为临床诊断工作提供借鉴。

临床资料

患者，男，50岁。因间断咳嗽、咳痰、胸闷、气促10个月，伴发热1周，于2020年6月13日入住西安市胸科医院。患者5年前无明显诱因出现咳嗽、咳白色黏痰，未行特殊处理。2019年8月27日患者因胸闷、气促，就诊于当地医院，诊断为“尘肺”，给予对症治疗后症状稍有好转，但活动后仍感到气促，休息后可缓解，随着病程进展，气促症状逐渐加重。患者于2020年6月5日出现发热，最高体温37.9°，午后明显，无畏寒、寒颤，就诊于山阳县中医医院，行胸部CT示双肺出现病灶并形成空洞，不排除肺结核可能，遂来我院做进一步诊断治疗。患病期间，患者无咯血，无胸痛和心慌，无恶心和呕吐，体质量6个月减轻10 kg。

入院时体格检查：体温37 ℃，脉搏92次/min，呼吸频率24次/min，血压140/100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。患者神志清楚，呼吸平稳，口齿清晰，全身皮肤黏膜无黄染，全身浅表淋巴结无肿大；胸廓正常，无肋间隙增宽；双肺叩诊清音，呼吸音粗，闻及干性啰音；心率92次/min，节律齐，无杂音；腹部柔软，无压痛、反跳痛；肝脾肋下未扪及；四肢活动正常，双下肢未见浮肿。

实验室检查：白细胞(WBC)5.53×109/L[正常范围：(3.50～9.50)×109/L]，血红蛋白(Hb)8 g/L(正常范围：130～175 g/L)，血红细胞沉降率(ESR)25 mm/1 h(正常范围：0～15 mm/1 h)，C反应蛋白(CRP)130.94 mg/L(正常范围：0～6.00 mg/L)；抗链球菌溶素O(ASO)、类风湿因子(RF)、免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)均阴性，结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)阳性；降钙素原1.05 μg/L(正常范围：0～0.50 μg/L)；结核抗体五项：38 kDa抗体阳性，培养滤液蛋白10(CFP-10)抗体阳性，其余为阴性。痰标本涂片分枝杆菌抗酸染色阳性(++++)。痰标本分枝杆菌复合群核酸检测(双通道PCR-荧光探针法)结果为非结核分枝杆菌核酸阳性。结核分枝杆菌核酸检测(RNA恒温扩增)结果为结核分枝杆菌阳性。为进一步验证双通道PCR-荧光探针法的假阴性及RNA恒温扩增检测假阳性的可能，用同一份标本进行结核分枝杆菌核酸检测(恒温扩增荧光法)，结果为阴性；GeneXpert MTB/RIF检测(巢式探针-荧光定量PCR法)结核分枝杆菌阳性，利福平野生型。同时对患者入院标本进行分枝杆菌BACTEC MGIT 960液体培养，1周后痰培养分枝杆菌阳性，MPB 64单克隆抗体检测阳性。痰标本直接提取的核酸样本及培养后细菌提取的核酸样本同时做分枝杆菌菌种基因鉴定(DNA微阵列芯片法)结果均为结核分枝杆菌。为进一步明确分子生物学检测结果不一致的原因，通过痰标本直接提取核酸及培养后细菌提取核酸进行IS6110基因测序，测序结果显示，该例患者感染的结核分枝杆菌为IS6110基因零拷贝菌株。对培养后的菌株进行结核分枝杆菌药物敏感性(微孔板法)试验显示除异烟肼和帕司烟肼耐药外，其余药品均敏感。

图1～4 患者，男，50岁。胸部CT扫描(2020-07-06)显示，双肺弥漫分布粟粒状、斑片状及条索样密度增高影，边界欠清晰，密度不均匀，双肺上叶近肺门处病灶实变，以右肺为著，局部伴空洞形成，右肺上叶部分支气管变窄；双肺门可见增大的淋巴结，伴钙化；双侧胸膜增厚、粘连

影像学检查：患者入院前查胸部CT(山阳县中医医院，2020-06-11)：胸廓对称无畸形，双侧肺野透光度降低，支气管血管束增重、紊乱，双肺弥漫性粟粒状、斑片状及条索状密度稍高影，双肺上叶后段可见较大不规则厚壁空洞，边缘毛糙，壁内凹凸不平，不光整，心影形态大小未见异常。入院后在我院查胸部CT(2020-07-06)：双肺多叶多段有散在分布微小结节密度增高影并空洞形成；尘肺；双侧胸腔积液及胸膜增厚粘连(图1～4)。

治疗情况：患者住院初期分子诊断已明确为结核分枝杆菌感染，而培养结果未出，无法进行药物敏感性检测，且患者病情复杂，病灶较重，遂给予左氧氟沙星加强抗结核治疗，联合H-R-Z-E(H：异烟肼；R：利福平；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)方案行抗结核治疗，并常规辅以预防性保肝治疗。入院15 d后分枝杆菌培养阳性，微孔板药物敏感性检测结果提示患者对异烟肼和帕司烟肼耐药，胸部CT检查(2020-07-06)结果显示治疗效果不理想。经过评估，对该例患者治疗方案进行修正，继续给予左氧氟沙星加强抗结核治疗，联合R-Z-E-Am(Am：阿米卡星)方案行抗结核治疗，并转至耐药科继续治疗，患者诉因家庭原因坚持出院，于2020年7月8日办理出院。

讨 论

结核分枝杆菌复合群是引起肺结核的主要病原体，IS6110是结核分枝杆菌基因组中的一段多拷贝保守序列，含有1361 bp核苷酸和28 bp的反向末端的重复序列，只存在于结核分枝杆菌复合群中[2]。对于我国广泛流行的北京基因型结核分枝杆菌[3]，根据菌株基因组核转录因子(nuclear transcription factors，NTF)区域中是否存在结核分枝杆菌特异性插入序列(insertion sequence，IS)6110，可分为北京基因型古代株和北京基因型现代株2个亚型[4]。北京基因型古代株的NTF区中没有IS6110，而北京基因型现代株 NTF 区中至少含有1个IS6110。

近年来，基于针对结核分枝杆菌特定序列的IS6110、hsp65、16S rRNA、rpoBRRDR区域、85B抗原、38 kDa抗原的某些序列的聚合酶链反应(PCR)扩增，已经开发了许多结核病分子诊断方法。虽然大多数结核分枝杆菌分离株中IS6110基因为高拷贝基因，但谢彤等[5]报道天津地区517例临床分离株中70株为IS6110基因缺陷株，其检出率高达13.5%，所以临床应用中要警惕单拷贝或零拷贝分离株对以IS6110为靶点的分子检测可能造成假阴性结果的可能。IS6110在结核分枝杆菌检测中具有特异性、稳定性及高拷贝性，相比于单拷贝的其他序列如 MPB64、MTP40等具有更高的敏感度和特异度，因此IS6110是目前临床分子生物学结核分枝杆菌诊断最常用的扩增靶点[6]。

但是IS6110低拷贝甚至零拷贝的结核分枝杆菌将会对以IS6110为检测靶点的检测方法的阳性率及准确性造成一定影响。我国已有文献报道IS6110缺失菌株(北京基因古代株)在中国不同地区的流行率为13.5%～23.57%[5, 7]。裴秀英等[8]对16株分离自上海的结核分枝杆菌菌株应用RFLP技术进行研究，发现1株IS6110零拷贝株和1株IS6110单拷贝株。然而，目前对于中国大部分地区IS6110拷贝数分布的研究还不足，低拷贝或零拷贝菌株对临床诊断的影响还需要进一步探究。

本例患者入院初期应用以IS6110和hsp65为靶基因的分枝杆菌复合群核酸检测方法(双通道PCR-荧光探针法)，结果为非结核分枝杆菌阳性，而以结核分枝杆菌复合群16S rRNA 序列特异性片段为靶标的结核分枝杆菌核酸检测方法(RNA恒温扩增)结果为结核分枝杆菌，出现两种分子生物学检测结果不一致的情况。为进一步验证检测结果的准确性，笔者又应用以IS6110为单靶基因的结核分枝杆菌核酸检测方法(恒温扩增荧光法)，结果为结核分枝杆菌阴性，而以rpoB基因81 bp利福平耐药核心区域(RRDR)为靶基因的GeneXpert MTB/RIF检测(巢式探针-荧光定量PCR法)，结果为结核分枝杆菌，利福平敏感。基于4种不同的分子生物学检测试剂得到的检测结果存在差异，通过分析各种检测试剂的检测原理及检测靶点，怀疑为IS6110基因缺失菌株，最后通过测序技术鉴定该例患者感染菌株为IS6110基因缺失。

本例患者出现两种分子生物学检测结果不一致的情况，对针对IS6110单靶点的PCR方法在结核分枝杆菌检测方面的可靠性会造成影响，导致假阴性结果的出现，而低拷贝菌株因其多态性有限，也同样会影响其在基因分型中的鉴定能力。因此，在结核病诊断方面需联合其他的基因靶点，如MPB64、MTP40、16S rRNA、hsp65等组成多重PCR法提高临床标本中分枝杆菌检测的准确性。

除了选择合适的靶基因，不同原理的分子生物学检测技术对结核分枝杆菌核酸检测阳性率也有一定的差异。本例患者应用4种方法对结核分枝杆菌进行核酸检测，在实际应用中都有可能出现假阳性或假阴性的情况，无法对原始标本中结核分枝杆菌拷贝数实现绝对定量。数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction，dPCR)是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术，比标准实时反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)具有更高的敏感度和准确性，且dPCR具有无需循环CT值和标准曲线即可实现样品中DNA分子绝对定量的优点[9]，未来可能对于低浓度和低拷贝的结核分枝杆菌核酸检测具有广泛的应用前景，但还需进行更多的研究加以证实。

综上，基于目前结核分枝杆菌的分子生物学检测诊断试剂的广泛应用，要警惕单拷贝或者零拷贝分离株对以IS6110为靶点的分子检测可能造成假阴性结果的可能。实验室检测人员需要对不同检测试剂的检测原理进行熟练掌握，当不同试验的检测结果出现不一致时，要积极协助临床进行分析，以免出现错误判断，延误患者的诊断与治疗。