鲍 芳，秘清灵，徐静雯，王 昱，吴剑梅，王志仙，王建业，朱国强

( 扬州大学 兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)属于细小病毒科细小病毒亚科依赖细小病毒属。MDPV基因组为一条线性单股DNA，以相等的极性存在于病毒粒子中[1]。基因组的两侧翼是由约450个碱基构成的末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR)，ITR可形成回文发夹结构并充当基因组复制的起始点[2-3]。基因组中间包含两个开放阅读框(open reading frame，ORF)，左侧ORF编码非结构蛋白Rep，受P9启动子调控，通过对mRNA的选择性剪切可生成Rep1以及其他几个相对分子质量更小的Rep蛋白[4]。右侧ORF编码结构蛋白Cap，受P41启动子调控，通过对mRNA选择性剪切以及起始密码子的选择性使用，可生成3个结构蛋白VP1、VP2和VP3，以约1∶1∶8的比例共同组成病毒衣壳[5]。

MDPV病是我国番鸭养殖业的一个重要疫病，主要发生在3周龄内雏番鸭，故俗称为番鸭“三周病”，患病番鸭表现为喘气、软脚、腹泻、运动失调，其发病率可达27%～62%，病死率为20%～55%[6]。20世纪80年代该病在我国首先报道[7]，后来法国、日本等国家也有报道[8-9]。

除了经典MDPV病以外，自20世纪90年代以来，在我国浙江、福建等番鸭养殖区还广泛报道过一种称之为“番鸭小鹅瘟”的疫病，该病特征性的解剖病理变化是在肠道出现类似小鹅瘟病例中的栓塞内容物，无论发病率还是致死率都要高于经典的“三周病”[10]。2018年浙江宁波某养殖场的7日龄番鸭暴发了一起疫病，病死率近60%，剖解死亡番鸭的肠道可见典型的栓塞，通过接种番鸭胚分离到1株病毒。本研究中，对该株病毒的基因组进行了测序和重组分析，结果表明该毒株为1株重组型的MDPV，表现在基因组的主体骨架，包括ITR和Rep基因均来自经典型MDPV，而在其VP3基因中间约1.1 kb区域以及P9启动子区整合了鹅细小病毒(GPV)的序列。

1 材料与方法

1.1 病毒MDPV NY18株分离于2018年，由本实验室于-75℃冻存。

1.2 生物学试剂Primestar Max高保真聚合酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DH5α感受态细胞，pMD19-T载体均购自大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶购自NEB公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。

表1 用于扩增NY18株基因组的引物和扩增片段大小

1.3 引物设计参照MDPV ZW株基因组序列(GenBank登录号KY744743)，合成了6对引物(表1)，这些引物扩增片段相互重叠，覆盖MDPV完整基因组，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.4 病毒核酸提取N18株病毒核酸提取参照文献[11]进行。DNA沉淀用30 μL去离子水溶解，-20℃ 保存备用。

1.5 PCR扩增和测序PCR扩增体系为50 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Primestar Max高保真聚合酶混合物25 μL，再用21 μL去离子水补齐。PCR循环条件：按照15 s/kb建立延伸反应，扩增30个循环。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后凝胶成像系统拍照。确认PCR产物阳性后，将剩余PCR产物全部上样进行琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，直接送商业化测序公司测序。对末端的约190 bp扩增片段则通过建立加“A”反应，再克隆入pMD19-T载体后进行测序。

1.6 序列比较和同源重组分析采用DNAStar软件包中的SeqMan程序对测序结果进行拼接获得完整基因组序列，用MegAlign程序中的Clustal W方法进行比对分析。采用Simplot 3.5.1和RDP4软件进行重组分析，MEGA-X 软件构建遗传进化树。

2 结果

2.1 基因组扩增和序列分析采用PCR分段扩增策略，以NY18株基因组为模板，成功扩增出预期的6个片段。PCR扩增产物经纯化后直接测序或克隆至T载体后测序，经SeqMan软件拼接后，获得了完整基因组序列。NY18株基因组由5 071个碱基组成，与经典型MDPV FZ91-30(GenBank登录号KT865605)和YY(GenBank登录号KX000918)株相比，NY18株在5′和3′端ITR处分别缺失28和2个碱基，但这些缺失碱基均处于互补位置，不影响余下碱基配对形成发夹结构。

2.2 重组分析采用Simplot 3.5.1 和RDP4软件一致检测到NY18株基因组产生了两处重组事件，其中较大范围的重组事件产生在VP3基因中间约1.1 kb范围内，该重组以经典型MDPV YY株为主要亲本，以经典型GPV 强毒株 DY16株(GenBank登录号为MH209633)为次要亲本。RDP4软件显示该次重组的断裂起始点在3 120碱基，断裂终止点在 4 251碱基处(图1)。第2个重组事件产生在5′ ITR的P9启动子区至Rep基因起始密码子ATG下游约100个碱基处，同样以经典型MDPV YY株为主要亲本，而以GPV鹅胚化弱毒疫苗株SYG61v为次要亲本。RDP4显示重组断裂起始点在 424 碱基，断裂终止点在615碱基处。

a.Simplot 3.5.1软件所做的重组分析；b.RDP4 软件所做的重组分析

2.3 ITR及编码蛋白序列分析基因组5′端和 3′端的ITR完全一致，均由424个碱基组成，其中外侧385个碱基形成回文发夹结构。5′ ITR的D区序列由39个碱基组成，和3′ ITR的D′区序列反向互补。NY18株的ITR与经典型MDPV FM和YY株的同源性分别为97.9%和99.1%，明显高于与GPV强毒株YZ99-6的同源性(86.0%)，表明其ITR 仍来自于经典型MDPV。

NY18株Rep1基因与经典型GPV毒株DY16和LH株的同源性均为83.3%，而与经典型MDPV FM、YY株的同源性分别为98.8%和99.0%，表明Rep1基因序列来自经典型MDPV。NY18株VP1基因与经典型GPV毒株DY16、LH株的同源性分别为90.1%和89.4%，与MDPV FM、YY株的同源性分别为89.3%和89.1%，表明NY18株的VP1基因与经典型GPV和MDPV毒株之间享有基本相等的核苷酸同源性，这一结果与产生在VP1基因内部的重组事件相吻合。通过对VP1蛋白氨基酸序列的进一步比对显示，NY18株在发生重组的同时，还分别在450,461,485,489,548,585,712位产生了7个特征性氨基酸点突变，这些位点的氨基酸既不同于经典MDPV毒株，也不同于经典GPV毒株，为NY18株所特有。

2.4 基于基因组不同区域的遗传进化树根据重组分析的结果，以重组区和非重组区序列分别构建遗传进化树。结果显示，以Rep基因C端1 774 bp和VP1基因N端694 bp和C端405 bp分别构建遗传进化树，NY18株均与经典型MDPV毒株处于同一分支(图2a、b、c)。以VP1基因1 100 bp的重组区构建系统发育树，NY18株则与经典型GPV毒株处于同一分支(图2d)。基因进化树结果与前述重组分析的结果也完全一致。

a.Rep基因羧基端1 774 bp；b.VP1基因氨基端694 bp；c.VP1基因羧基端405 bp；d.VP1基因重组区1 100 bp片段

3 讨论

重组型MDPV在临床上具有两个特点，一是相较于经典型MDPV，可对较高日龄的番鸭致病，对雏番鸭呈现出更高的病死率；二是在雏番鸭感染死亡的临床病例中，可见肠道出现栓塞。NY18株分离于2018年暴发的一起番鸭病例，事实上，自20世纪90年代中期开始，特别是在浙江省，类似的以肠道栓塞为特征的病例就多有报道[10]；这表明尽管这一时期已有经典的MDPV活疫苗在田间使用，但对NY18株类似的病毒株感染明显缺乏保护力，致使这一类型毒株一直在田间流行，持续威胁我国番鸭养殖业的健康发展。

重组是病毒快速进化的一种手段，可以使病毒株获得新的抗原性，从而逃避原有疫苗的保护得以在田间持续传播。VP3是MDPV和GPV的主要结构蛋白[5,12-13]。在1.1 kb的VP3重组区，NY18 株共有33个氨基酸位点与经典型MDPV不一致，而与GPV毒株一致。此外，我们还发现，在重组之外，NY18株在VP1 的7个氨基酸位点产生了特有的点突变，这些位点既不同于经典型MDPV，也不同于GPV，其中6个突变位点均产生在1.1 kb的重组区，1个(712位)产生在VP1的羧基末端。因此，点突变和重组共同塑造了NY18株的结构蛋白序列组成，使之成为一个高适配性的重组型MDPV，能够在一个较长的时间持续在中国的番鸭群中流行。

NY18株的ITR与经典型MDPV毒株高度同源，显示其来源于经典型MDPV，因而与同样来自经典型MDPV的Rep蛋白的互作不会受到减弱。SYG61v株是一个鹅胚传代减弱的毒株，可在雏鹅上使用防制GPV病[14-15]，具有特征性的P9启动子序列。NY18株在此处与SYG61v株产生了重组，并且这次重组区域延伸到Rep1阅读框上游100 nt处，一个特征性结果是Rep1的第3位氨基酸不同于经典型MDPV(P→T)，而与GPV一致。一个相对毒力减弱的P9启动子在重组型MDPV致病性中的意义尚需要进一步深入研究。

总之，本研究揭示了NY18株作为重组型MDPV的分子特征。已有资料显示，这类毒株已在安徽省的番鸭养殖区流行[16]，鉴于这类毒株已对番鸭养殖业所造成的经济损失，开展针对该类毒株的分子流行病学监控以及开发基于重组型MDPV毒株的弱毒活疫苗研究显得十分重要。