宋波，张晓杰，王俊生，严志军，刘志坚，潘新祥

(1.齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔161000；3.大连海事大学信息学院 ，辽宁 大连 116026；4.广东海洋大学校长，广东 湛江 524088)

0 引言

随着抗生素的过度使用，耐药菌株逐年上升，使控制耐药菌感染性疾病的治疗压力不断增大。我国传统药用植物资源丰富，来源广，毒副作用小，价格低廉，有些天然植物或者其提取液具有良好的抗菌活性，且较少出现耐药性，具有良好的应用前景，从中药中筛选微生物抑制剂具有重要意义[1-2]。中药在我国分布广泛，历史悠久，经常被用于治疗各种炎症、头痛眩晕、心血管疾病和呼吸道疾病[3-5]。本文通过检测中医院呼吸道感染药方，采用常用的清热解毒抗菌类中草药菊花、金银花、连翘、炒苦杏仁、麻黄、射干、板蓝根、荆芥、桔梗、淡豆豉、石膏、知母、桑叶、甘草对临床标本大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行抑菌效果观察，探讨中草药对菌株的体外抗菌活性，以为研发抗耐药菌新药提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均由齐齐哈尔医学院附属医院检验科提供，采用美国BD公司细菌鉴定仪phoenix100进行菌种鉴定。质控菌株为大肠杆菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)[6]，白色念珠菌(ATCC10231)均由齐齐哈尔医学院附属医院提供。

1.2 菌悬液的制备

将采集的菌株，以平板划线的方式接种于灭菌的LB固体培养基上进行活化，37℃恒温箱中培养24 h，观察菌落形态，用接种环挑取单个菌落，接种至LB液体培养基中，菌悬液制备完成[7]。

1.3 中药

根据齐齐哈尔市中医院呼吸道感染常用药方选取菊花、金银花、连翘、炒苦杏仁、麻黄、射干、板蓝根、荆芥、桔梗、淡豆豉、石膏、知母、桑叶、甘草14种中药，以上中药均购于齐齐哈尔市中医院。

1.4 实验方法

1.4.1 药敏纸片扩散法测量抑菌圈直径

药敏纸片的制备：精确称取菊花等中药，使用pH=7.6的PBS配制，使其药液浓度为2g生药/mL，4℃保存备用[8]。使用打孔器将滤纸制作为直径6mm的小纸片，高压锅121℃，灭菌15min后备用，制备成浓度为1：1原液的含药纸片，每张纸片中含有10μL的中药。药敏纸片扩散法：通过测量抑菌圈直径来判断中药液的抗菌敏感性。在MH培养基上分别将0.5 MCF的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均匀涂满整个平板，在平板培养基上等间距地贴上药敏纸片，含灭菌水的空白药敏纸片作为阴性对照。37 ℃培养24 h后，使用游标卡尺以十字交叉法测量各中药液的抑菌圈直径，每组做3个平行试验，计算其平均值[2]。

1.4.2 微量肉汤稀释法分析菊花等中药对细菌的最低抑菌浓度(MIC)菌液的制备

分别取一接种环的待测菌，接种至LB液体培养基中，配制成浓度约为0.5 MCF(1.5×108cfu/mL)的菌液。药液的制备：采用2倍稀释法将浓度为2000 mg/mL的连翘等中药液用无菌水等比稀释原则，使其稀释成浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.813、3.906 mg/mL的药液。微量肉汤稀释法：在含有不同稀释度药液的96孔板中，每孔加入待测菌液100μL，每个浓度各设3支平行管，混匀。不含药液的菌液稀释液作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。37℃培养24h，从各孔中取出10μL液体，接种于LB固体培养基上，37℃培养24h，观察实验孔和阴阳对照孔的细菌生长情况。以无菌生长平板(清澈透明)的最低药物浓度为MIC[7]。

2 结果

2.1 连翘等中药对细菌的抑菌效果的观察

通过观察中药药敏纸片周围是否出现抑菌环，判断该中药对细菌是否具有抑菌作用。由表1可知，对大肠杆菌有抑菌效果的中药是菊花、金银花、连翘、荆芥、知母、桑叶、甘草，对金黄色葡萄球菌有抑菌效果的中药是金银花、连翘、知母、桑叶、甘草，对白色念珠菌有抑菌效果的中药是连翘、桑叶、甘草。

2.2 七种敏感中药抑菌环直径的测量

抑菌结果的判定：抑菌圈直径＜7.5 mm为耐药；在7.5～10 mm为轻度敏感；在10～14 mm为中度敏感；在15～20 mm为高度敏感；＞20 mm为极度敏感[8-9]。由表2和图1可知，不同中草药的抑菌作用效果不一样，连翘和荆芥对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均＞20 mm，属于极度敏感，甘草对供试菌菌的抑菌圈直径均＞10 mm，属于敏感，但是对白色念珠菌中度敏感，桑叶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径＞10 mm，属于敏感，但是对白色念珠菌不敏感，菊花对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌圈直径＞10mm，属于中度敏感，对白色念珠菌表现为低度敏感。七种中草药对金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，连翘的抑菌效果尤为明显，抑菌圈的直径为21 mm；对大肠杆菌均有抑制作用，其中荆芥的抑菌效果最好，抑菌圈的直径达到了22 mm；甘草、菊花、连翘、金银花、荆芥、桑叶对白色念珠菌均有一定的抑菌作用，知母对白色念珠菌无抑菌环产生，属于无抑菌作用。

2.3 七种敏感中药对细菌的最低抑菌浓度(MIC)测定

为了解各中药对细菌的抗菌效果，选取敏感中药菊花、金银花、连翘、荆芥、知母、甘草、桑叶七种中草药，按二倍稀释法分别稀释成不同的浓度梯度，通过测定每种中药的最低抑菌浓度(MIC)对其抗菌效果进行研究，结果见表3、4、5。

菊花、金银花、连翘、荆芥、知母、甘草、桑叶对大肠杆菌最低抑菌浓度MIC值为0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.25 mg/mL 、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.25 mg/mL，菊 花、金银花、连翘、荆芥、知母、甘草、桑叶对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC为0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.25 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL，菊花、金银花、连翘、荆芥、甘草、桑叶对白色念珠菌的最低抑菌浓度MIC为0.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL。

表1 连翘等中药对细菌的抑菌效果的观察

表2 七种敏感中药对细菌的抑菌环直径的比较(mm)

图1 七种敏感中药对细菌的抑菌环直径的图示

表3 七种中药对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)

表4 七种中药对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)

表5 七种中药对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)

3 讨论

3.1 研究结果及国内外同类研究比较

本研究结果表明，连翘、荆芥、甘草、桑叶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有较强的抑制作用，由表2可知，荆芥对金黄色葡萄球菌抑制能力较强，对大肠杆菌中度敏感，对白色念珠菌抑制能力较弱，这与研究报道[9-11]荆芥挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌结果相符。连翘、甘草对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较好，甘草对于大肠埃希菌、白色念珠菌的抗菌活性差别不大，这与研究报道[12]一致。研究表明本组药物产生抑菌作用的主要药物是连翘与荆芥，是两种抑菌谱很广的、抑菌效果很好的中药，与前人研究结果[13]吻合。甘草、菊花、连翘、金银花、荆芥、桑叶对白色念珠菌均有抑菌作用，但知母对白色念珠菌无抑菌作用，该结果与杨坤等[14]的报道结果不同，可能知母作为联合用药时可以发挥其协助抑菌作用，但单独使用时，未产生抑菌作用。

呼吸道感染是导致院内感染死亡的主要原因，且近年来其感染致死率呈上升趋势[15]。金黄色葡萄球菌[16-18]，大肠杆菌[19-20]和白色念珠菌[21-22]是人类呼吸道感染的常见病原菌，目前对传统抗生素耐药率高，且有逐年上升趋势，及时准确的药物治疗对改善患者的结局具有很重要的意义[23]。

3.2 研究的创新性、先进性

中药在我国分布广泛，可有广谱抗菌、免疫调节、安全及副作用小等多种用途[24-25]。本研究选择中医院呼吸道感染常用药方，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌为代表菌进行药物的初步筛选，采用了抑菌环直径和MIC两种指标显示各种中药抑菌效应的强弱，观察抑菌效果，评价药方中14种中草药抗菌效果的差异。

3.3 研究的不足及展望

本研究不足之处在于样本量小以及选用的测试菌种类较少，未来将扩大样本量以及增加测试菌样品种类继续进行深入研究，