范亚莉，洪军，郭小英，顾锡娟，殷青宁，王珍，蒲兰青

青海省妇女儿童医院急诊科，青海 西宁 810007

人类不同个体对新环境的遗传学适应是一个漫长的过程，高海拔适应正是该过程的最好体现[1]。青海地区位于我国西北部，平均海拔在4 000 m以上，氧气含量只有平原地区的40%，紫外线强度比内地要高30%[2]。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的主要功能是平衡体内氧含量，其主要由α和β两个亚基构成，其中的HIF1-α亚基受缺氧调控并调节HIF-1的活性，是体内重要的氧含量调节因子[3]。研究表明，低氧信号通路是调节红细胞生成的重要途径，在低氧或缺血损伤条件可阻碍HIF-1α的羟基化过程，使其稳定性增强，从而发挥低氧、缺血条件下的适应和保护作用[4]。本文就HIF-1α基因的9 个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点基因多态性与青海地区不同海拔、民族、性别和年龄人群的相关性进行研究，为未来利用SNP多态性差异对高原地区相关个体相关疾病预防和治疗提供一定的科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据知情同意原则，以青海省西宁和玉树地区进行健康体检人群作为研究对象，随机采集2018—2020 年位于海拔2 300 m 的西宁地区(50 例)和海拔 4 000 m 的玉树地区(100 例)的不同民族(藏族 72 例，非藏族 78 例)、不同年龄(学龄前组30 例，青少年组 120 例)和不同性别(男、女各 75 例)人群的外周血样本。以上研究对象均在青海省居住10 年以上，本研究经过青海省妇女儿童医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP位点选取及引物设计 根据Hap Map数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中选取HIF-1α基因的 9 个 SNP 位点(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467和rs1802821)，引物由使用Primer5.0设计。

1.2.2 基因分析 将已提取的DNA 及试剂从-20℃冰箱取出后置于室温下解冻，振荡混匀，短暂离心。将Custom Taqman®探针(40×)、LightCycler®480预混液(2×)、无DNase 水按说明配好后分装至384 孔板中，每孔 4 μL，按顺序将1 μL DNA 模板加入相应孔中。贴好贴膜，刮平，板式离心机2 000 r/min 离心1 min。使用Roche LC480Ⅱ型荧光定量PCR 仪，按照：95℃ 10 min，95℃ 10 s退火、60℃延伸45个循环的设置，扫描读取9个SNP位点的探针信号，选择Genotyping进行等位基因分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件，采用χ2检验比较各因素两种对象中对应SNP位点的基因型表达差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各群体中9 个SNP 位点基因型分布 对HIF-1α基因9 个SNP 基因型进行比较分析后发现，SNP 基 因 型 rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549465 和 rs11549467 在民族、区域、年龄和性别四个方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。但其中 rs61755705 在 150 例样本中为纯合子，皆为GG基因型；rs41508050在所有样本中为纯合子，皆为CC型；rs1802821在在民族、区域、年龄和性别四个方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，且在150 例样本中都为AA 基因型。而rs1957757 和rs11549465分别在年龄和性别中比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2 各群体中9个SNP位点等位基因分布 对青海西宁和玉树地区藏族和非藏族、学龄前和青少年以及不同性别之间群体中HIF-1α基因9 个SNP 位点使用Genotyping 进行等位基因分型检验和分析，见表 2。实验结果表明，9 个 SNP 的等位基因中，SNP 位点 rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549467 和rs1802821 在民族、区域、年龄和性别方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，而SNP 位点rs1957757 和 rs11549465 在年龄和性别中比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 HIF-1α基因SNP基因型在不同群体中的分布比较(例)

表2 HIF-1α基因SNP等位基因在不同群体中的分布比较(例)

3 讨论

HIF-1α广泛表达于多个物种的各组织细胞中，研究表明，HIF-1α基因缺失的小鼠胚胎会因大脑、心脏和血管系统的发育异常而在怀孕中期死亡，说明其在正常发育过程中具有重要作用[5-6]。HIF-1α在常氧条件下很快会被降解，而低氧条件会促进其与β亚基结合形成HIF-1复合物，从而促进和保护机体对低氧环境的适应能力[7]。HIF-1α在人类染色体上编码基因的位置为14q21-24，具有14个内含子和15个外显子[8-9]。研究表明，HIF-1α在不同海拔引起的不同低氧环境中表现出选择作用，这种作用与多种疾病如大脑神经元损伤等有着密切关系。

本研究根据我国多民族人群HIF-1α的基因多态性特点，结合国内外文献，最终选取了9 个有代表性的SNP 位点(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467 和rs1802821)。结果显示，在西宁和玉树地区、藏族和汉族、青少年和学龄前以及不同性别四组中，rs61755705、rs41508050 和rs1802821 三个位点在150 例样本中均为纯合子，分别为 GG、CC 和 AA 基因型。SNP 位点rs1957757 和rs11549465 等位基因与基因型在年龄和性别中具有显著性差异，说明该位点等位基因与年龄和性别因素具有相关性。李晟等[9]的研究结果表明，HIF-1α的rs4899056和rs10873142 SNP位点的变异与一氧化碳中毒后中枢神经脱髓鞘损伤有关，从而影响HIF蛋白的功能，但HIF-1α的rs4899056和rs10873142两个SNP位点在本研究的四组中并未表现出相关性，而在正常组中无变化的rs1957757，在本研究中却表现出了性别和年龄组中的差异，提示低氧环境差异可能对HIF1-α基因有选择作用。

青海常住居民对高原环境的适应有着独特的生理学特征。本课题组前期的研究表明，在青海玉树地区，不同性别、不同年龄和不同民族儿童的淋巴细胞亚群分布存在差异[10]。以往针对高海拔地区人群的遗传学研究主要为EPAS1和EGLN1，该两种基因的多态性对藏族人群高海拔适应具有促进作用，研究表明，这种适应作用与该基因影响藏族人群的血红蛋白浓度密不可分[2]。而EGLN1是HIF-1α的上游基因，当其在低氧或其他因素所致的基因表达量改变时，也会影响下游HIF-1α的低氧应答，从而通过缺氧诱导因子(hypoxia induced factor,HIF)促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)信号通路中的相关低氧信号蛋白(hypoxia pathway protein，HPP)，最终促进机体在高海拔环境下的低氧适应[4]。

综上所述，青海地区HIF-1α基因多态性与年龄和性别有相关性。但本文尚有不足：(1)难以获得更多的民族和年龄组的样本，造成样本量偏小；(2)缺乏HIF-1α上下游相关重要基因的研究，造成研究内容不够系统；(3)缺少平原地区(0 海拔)研究数据作为对照。建议后期做更大的样本和更完善的对照指标，进行进一步验证。