潘思琼，陆奉科 ，李山

1.广西医科大学第一临床医学院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第四附属医院病理科，广西 柳州 545000；3.柳州市妇幼保健院输血科，广西 柳州 545000

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道较为常见的恶性肿瘤之一，发病率位居全球恶性肿瘤第三位，也是中国癌症死亡的第二大原因[1]。在欧洲，2018 年估计有38.8 万例新发病例和17.4 万例相关死亡病例。我国每年新增病例超过25 万例，约14 万患者死于CRC[2]。研究报道，10%～20%的散发性结直肠癌与DNA 错配修复蛋白(mismatch repair proteins，MMRP)功能的损伤有关，错配修复缺陷导致遗传不稳定，即微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)[3]。约 40%的 CRC 病例中发现 p53 突变，p53 突变体可获得加速恶性进展、增加肿瘤侵袭和转移功能，在CRC 发育过程中可以发挥一个非常重要的作用。本研究采用免疫组织化学方法对结直肠癌组织标本中错配修复蛋白(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)和p53 进行检测，分析其与临床病理特征之间的关系，为结直肠癌的临床治疗和预后评价提供一个有效的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集广西医科大学第四附属医院2019 年1 月至2020 年6 月经病理确诊的结直肠癌标本261例，标本术前均未经过化疗或放疗，所有患者有较完整的临床资料。其中男性162 例，女性99 例；年龄29～92岁，中位年龄62岁。本研究受医院医学伦理委员会认可。

1.2 主要试剂 鼠单抗MLH1、鼠单抗MSH2、兔单抗MSH6、兔单抗PMS2及鼠单抗p53均购自福州迈新公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、MaxVision-HRP 鼠/兔免疫显色试剂、DAB显色液均由病理科提供。

1.3 方法 所有标本经10%中性福尔马林进行固定，脱水，石蜡包埋，选取4 μm 切片，经65℃烤片2 h，脱蜡水化，抗原修复(EDTA 缓冲溶液高压热修复)，浸泡3%H2O2，阻断内源性过氧化酶的活性，滴加一抗，室温孵育1 h，PBS 缓冲液冲洗，再滴加二抗，室温孵育20 min，PBS缓冲液冲洗，DAB显色液显色，苏木素复染胞核，盐酸分化，梯度酒精(低至高)进行脱水，中性树胶封片。

1.4 结果判断 MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 均定位于细胞核，胞核呈现黄色或棕黄色颗粒则判断为阳性表达，胞核不着色为缺失。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任意一种缺失判定为MSI。p53表达出现于细胞核，核呈黄色或棕黄色判断为阳性。所有免疫组化结果由两位经验丰富的资深病理学专家共同诊断。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 软件进行统计学分析，计数资料采用连续校正χ2检验；采用Spearman等级相关分析各指标之间的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMRP、p53 在 CRC 中的表达 261 例 CRC中MMRP 阳性者为248 例(95.0%)，表达缺失者为13例(5.0%)，其中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 表达缺失者分别为 7 例(2.7%)、3 例(1.1%)、8 例(3.1%)、4 例(1.5%)。 MLH1 和 PMS2 共 同 表 达 缺 失 者 为 7 例(2.7%)，MSH2 和 MSH6 共 同 表 达 缺 失 者 为 2 例(0.8%)。p53阳性表达者为211例(80.8%)，阴性表达者50例(19.2%)，见图1。

2.2 MSI、p53 表达与 CRC 临床病理特征的关系 MSI 与结直肠癌患者性别、肿瘤直径、年龄、部位、分化程度、淋巴结是否转移及肿瘤浸润深度均无关(P＞0.05)，p53与患者性别有关(P＜0.05)，见表1。

2.3 MSI 与 p53 的相关性 MSI 与 p53 表达无相关性(r=-0.111，P＞0.05)，见表2。

图1 MMRP蛋白、p53在CRC中的阳性表达(10×10)注：A，MLH1 在 CRC 中的阳性表达；B，MSH2 在 CRC 中的阳性表达；C，MSH6 在CRC 中的阳性表达；D，PMS2 在 CRC 中的阳性表达；E，p53 在CRC中的阳性表达。

2.4 MLH1 与 PMS2、MSH2 与 MSH6 的 相 关性 MLH1 与 PMS2 表达呈正相关(r=0.934，P＜0.05)，MSH2与MSH6表达呈正相关(r=0.572，P＜0.05)，见表3。

MLH1PMS2 MSH2 rs值P值MSH6rs值P值-+-7 1+0＜0.050.072+0 0.572＜0.05 253-+-3 1 257

3 讨论

CRC是胃肠道系统中一种异质性恶性肿瘤，它是由多阶段及多种因素发展而来的复杂性疾病，其病因可能与生活方式(吸烟、饮酒等)、个体不同的遗传背景、环境因素以及肠道菌群与宿主免疫系统的动态失衡有关[4]。错配修复基因是DNA 损伤反应通路的一个重要组成部分，负责维持基因组的完整性[5]，包括MLH1、MSH2、PMS2、MSH6等。MMRP能很好地纠正微卫星中的移码突变和DNA复制过程中产生的不匹配核苷酸，其表达异常可导致肿瘤抑制基因、原癌基因或DNA修复基因突变，使正常结肠上皮细胞转化为肿瘤细胞[6]。而微卫星不稳定是指短串联重复序列(编码区和非编码区)普遍不稳定，在DNA修复过程中，错配修复基因编码相应的酶，也可以识别碱基对，如果MMR缺陷或突变会损害细胞DNA能力，可能会导致细胞死亡或基因组不稳定[7]。因此，MMRP中的MLH1、MSH2、PMS2、MSH6在结直肠癌发生发展过程中具有重要意义。

本研究发现，261 例 CRC 中 MSI 发生率为 5.0%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6表达缺失者分别为2.7%、1.1%、3.1%、1.5%。根据胡晓儒等[8]研究658例结直肠癌中错配修复蛋白的表达，结果显示MSI 发生率为6.7%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6、表达缺失者分别为4.1%、2.3%、4.3%、2.4%，与本实验结果相近。而另据国内外有文献报道MMRP 表达缺失率在15%左右[9-10]，这一发现可能反映了MMRP在不同人种、不同地域间存在差异，也可能与遗传因素和生活方式与肿瘤的特征密切相关。此外，统计学分析显示，MSI的表达缺失与性别、年龄、部位、肿瘤直径、肿瘤分化程度和细胞浸润深度无相关性，与淋巴结转移有关，其发生机制有待进一步研究。PMS2的缺失与发病部位有关，发生在右半结肠较为多见，这可能与各种生物学和临床差异，包括胚胎起源、生理功能和血管供应相关[11]。右侧结直肠来源于中肠，由肠系膜上动脉供血，常表现为全基因组的高甲基化、MSI-H高突变。而左侧结直肠来源于后肠，由肠系膜下动脉供血，包括染色体不稳定所导致。

在本次研究对象中，MLH1 和PMS2 共同缺失者有 7 例，MSH2 和 MSH6 共同缺失者有 2 例，MSH2 和MSH6、MLH1 和 PMS2 均呈正相关(r=0.934，P＜0.05；r=0.572，P＜0.05)，表 明 MLH1 和 PMS2、MSH2 和MSH6 经常共同缺失或表达，可能与蛋白质异源二聚体、MSH2 二聚体和 MSH6、MLH1 二聚体和 PMS2 分别形成功能复合物大肠杆菌(MutS inhibitor)和大肠杆菌(MutL inhibitor)有关，MSH2蛋白是其异源二聚体的先决条件，MSH2 突变可导致 MSH2 和 MSH6 蛋白同时缺失[12]。而MLH1缺失是MMRP中最常见的模式，其原因可能是由于MMRP缺失时，MLH1基因进行启动子高甲基化，使其在DNA损伤修复中分别与其同源性MMRP形成复合体导致MMR蛋白表观遗传症状[13]。

p53 基因是最重要的肿瘤抑癌基因之一，位于17号染色体的短臂，参与组织细胞凋亡或细胞生命周期阻滞、DNA 损伤修复等过程[14]。p53 基因突变是导致肿瘤进展的主要原因，大约50%的癌症患者中发现其突变[15]。有研究显示，突变型p53 CRC 患者比野生型p53 患者化疗耐药更严重，反映了p53 突变状态在CRC 进展及预后不良中发挥重要的作用[16]。在本次研究中p53的阳性率为80.8%，与性别有关，与肿瘤细胞浸润深度、淋巴结转移无关，p53 表达与MSI 无相关性，实验结果与其他文献的研究结果有所差异。可能是由于观察到的p53过表达不一定与p53基因突变有关。不同类型p53 突变引起的致癌机制不同，野生型p53 的缺失影响侵袭过程，突变型p53 获得功能获得(GOF)活性，也可能是由于MSS 型和MSI 型结直肠癌具有不同的致癌机制和通路，而且地域种族、其他遗传或非遗传、非标准化操作等因素也可导致结果不一致。

综上所述，结直肠癌中错配修复蛋白表达的部分缺失，与其临床病理特征关系密切。p53 表达与MSI是否存在联系，尚需要多中心大量的标本进行进一步的研究证实。而通过检测MMRP及p53指标，对CRC的早期进行诊断、风险管理评估及预后评价具有一定的参考意义。