石禹，姚行，韦路丝，赵训晓，李妃，肖曼，王晗

海南医学院生理学教研室，海南 海口 571199

肝癌是目前世界上死亡率极高的癌症之一，因为其早期无明显的症状，晚期治疗困难，导致治疗效果不佳[1]。相关研究发现，中草药龙血竭不仅有活血化瘀的功效，同时也有抑制肝癌细胞生长的作用[2-3]，但龙血竭抑制肝癌细胞生长的机制尚不清楚。现有资料表明，TLR4不单表达于免疫细胞当中，它的沉默表达还能够对肝癌细胞的生长产生影响[1，4-5]。为此，本课题以此为切入点，主要探究龙血竭是否通过调控toll 样受体4(toll-like receptor-4，TLR4)基因的表达影响肝癌细胞的生长。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 本研究所使用细胞为冻存于海南医学院分子生物学重点实验室的人肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15。

1.1.2 主要试剂 龙血竭购于中国(海南博大制药厂)，高糖DMEM购于中国(Hyclone公司)，胎牛血清购于美国(BI公司)，青链霉素双抗购于中国(上海碧云天公司)，DMSO 购于美国(SIGMA公司)，CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购于日本(DOJINDO 公司)，Eastep Super Total RNA Extraction Kit 购于美国(Promega 公司)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix购于中国(北京全式金公司)，anti-TLR4抗体购于美国(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 培养肝癌细胞系HepG2 和HepG2.2.15，分别将以上两种肝癌细胞随机等量分为对照组和上药组，上药组在培养基中加入龙血竭，对照组仅加入等量细胞培养基。

1.2.2 细胞培养 配置含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL 的DMEM 高糖培养基，将HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞置于其中，于37℃、5%CO2培养箱饱和湿度下培养，每1～2 d传代一次。

1.2.3 细胞增殖抑制率检测 将生长状态至对数生长期的HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞进行消化，制备细胞悬液并计数，根据每孔4 000 个细胞的96 孔板中的细胞数量，配制浓度为 2×104个/mL 细胞悬液。向每孔加入200 μL 细胞悬液，培养箱培养24 h 待其贴壁。细胞贴壁后，弃去96 孔板中的培养基，加入100 L 不同浓度(浓度梯度分别为0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、140 μg/mL、160 μg/mL、180 μg/mL)的龙血竭培养基，再等待24 h。龙血竭处理24 h后，向每个孔中加入10 μL CCK-8，并置于5%CO2培养箱中30 min。每个孔的吸光度值在OD450下测量。测试后，将其放回37℃的培养箱中继续反应，培养4 h 后终止。以龙血竭浓度为横坐标，平均抑制率为纵坐标，绘制浓度-抑制率曲线。计算龙血竭作用于细胞后在每个孔中不同浓度的抑制率。抑制率(%)=(给药OD 值－空白组OD值)/(不给药OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测TLR4 mRNA 表达水平 利用总RNA 提取试剂盒提取各组细胞中的总RNA，再利用逆转录试剂盒将提取的总RNA 进行逆转录，以β-actin[6]为内参，扩增后，以 2-ΔΔCt方法计算HepG2 和 HePG2.2.15 细胞中 TLR4 mRNA 的表达。所用引物序列为：TLR4 上游，5"-AGACCTGTCCCT GAACCCTAT-3"；TLR4 下 游 ，5"-CGATGGACTTCT AAACCAGCCA-3"[7]；β-actin 上游，5"-TCCTGTGGC ATCCACGAAACT-3"；β-actin下游，5"-GAAGCATTT GCGGTGGACGAT-3"。

1.2.5 Western-blot 检测TLR4 蛋白表达水平 用BCA 蛋白定量法提取各组细胞并进行定量。然后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、膜转移和5%脱脂奶粉密封1 h。加一抗anti-TLR4抗体(1∶500)和anti-GAPDH 抗体 4℃温育过夜。TBST 洗膜 3 次×10 min，二抗(1∶1 000)室温温育1 h，TBST洗膜3次×10 min，ECL 化学发光剂暗室显影。

1.3 统计学方法 实验中的所有数据均采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 龙血竭对HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞增殖的影响 采用CCK-8法进行细胞增殖检测，龙血竭对HepG2 和HepG2.2.15 细胞增殖的影响见图1。经24 h 不同浓度龙血竭处理的HepG2细胞和HepG2.2.15细胞抑制率与药物浓度呈正相关，当龙血竭浓度增加时细胞抑制率随之增加。加入龙血竭后，HePG2、HePG2.2.15两组细胞系生长速度明显减慢，IC50值分别为(97.78±8.19)μg/mL和 (66.89±5.86)μg/mL。

2.2 龙血竭对HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞TLR4 mRNA 表达水平的影响 分别使用IC50 浓度的龙血竭处理HepG2细胞和HepG2.2.15细胞，提取各组总RNA 并逆转录，实时荧光定量方法检测TLR4 mRNA的表达水平见表1。与未经龙血竭处理的细胞相比，经龙血竭处理的HepG2 和HepG2.2.15 细胞的TLR4 mRNA 表达水平明显降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 龙血竭对HepG2 细胞和HepG2.2.15 细胞中TLR4mRNA 表达的影响

2.3 Western-blot 法检测TLR4 的蛋白质表达水平 分别使用IC50 浓度的龙血竭处理HepG2 细胞和 HepG2.2.15 细胞，Western-blot 检测 TLR4 蛋白的表达水平，结果见图2。与未经龙血竭处理的细胞相比，经龙血竭处理的HepG2 和HepG2.2.15 细胞的TLR4 蛋白表达明显降低[(0.89±0.05)vs(0.68±0.06)、(1.11±0.04) vs (0.56±0.08)]，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 龙血竭对HepG2细胞和HepG2.2.15细胞TLR4蛋白表达的影响

3 讨论

人肝癌细胞系HepG2 来源于一位15 岁白人的肝癌组织，HepG2.2.15 细胞是由两个头尾相连的HBV-DNA全基因的重组质粒转染HepG2细胞而建立的细胞系。本文主要是以HepG2 细胞和HepG2.2.15细胞为研究对象，用CCK8 法测得龙血竭在这两种细胞中的IC50 浓度，并采用实时荧光定量PCR 和Western-blot 技术对龙血竭通过TLR4 作用于HepG2 细胞和HepG2.2.15细胞的可能性进行了研究。

原发性肝癌(以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第四位，肝癌病情发展极快，死亡率居恶性肿瘤第三位，被称为“癌中之王”[8]。长期的临床实践表明，中医药可以降低肝硬化患者的肝癌发病率，它在治疗肝硬化方面有很好的优势。OKA等[9]随访5 年，观察小柴胡汤颗粒治疗肝硬化的疗效，结果发现，与安慰剂对照组相比，小柴胡汤可降低肝硬化患者肝癌的发病率和病死率。中药成分多种多样，其作用具有多渠道、多层次的综合效应，也是其对复杂肝纤维化病理具有良好疗效的重要基础。

原始植物如龙血树的木质部在受到外力破坏或被微生物侵入后会分泌红色树脂[10]。自古以来，这种树脂被称为血竭，是传统名贵中药[11]。现代药理学研究证明血竭具有消炎、止血、镇痛[12]、止泻、抗溃疡[13]、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用，广泛应用于跌打损伤、外伤出血、溃疡、瘀滞疼痛等临床治疗。在预防和治疗冠心病、缺血性心脏病和高脂血症等方面也有很好的效果[14]。剑叶龙血树是目前国产血竭的主要原料[15]，同时，近年来也发现海南岛广泛分布的常见植物柬埔寨龙血树也能产生红色树脂，初步临床医学证明海南龙血竭的药理和临床效果与进口龙血竭基本相同[16]。相关研究还表明，海南龙血竭对人肝癌细胞的生长具有抑制作用[3]。本研究通过CCK8 法也证实了龙血竭能够使肝癌细胞的生长受到抑制，抑制作用随着龙血竭浓度的增加而逐渐增强。

TLR4全称为Toll样受体，作为炎症信号传递过程中的一种门户蛋白，它在免疫防御反应中发挥着重要作用。研究人员发现，TLR4 在许多不同组织的肿瘤细胞表面表达，这可能与肿瘤免疫微环境的建立和维持有关[17-19]。肝癌细胞的表面也有TLR4的表达，可能与介导肝癌的发生发展有相关联系[20]。通过实时荧光定理PCR 和Western-blot 分别检测两种肝癌细胞系中TLR4 的mRNA 和蛋白表达水平，结果发现龙血竭能够明显抑制TLR4 的表达，证实龙血竭可能通过TLR4信号通路抑制了肝癌细胞的生长。本研究验证了龙血竭对肝癌细胞确实起到抑制作用，并初步探讨了龙血竭是否通过调控TLR4 基因对肝癌细胞起到抑制作用。

现有研究发现在肝免疫异常、炎症反应触发的肝损伤、肝星状细胞的活化及肝纤维化恶化与肝癌的发展中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路均有重要调节作用[21]，未来可在龙血竭是否通过调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路抑制肝癌细胞的生长的方向进行深入研究。

目前关于肝癌的研究很多，但能有效治愈肝癌的药物数量仍然有限，本研究试图通过探讨龙血竭抑制肝癌细胞生长的机制，从而为肝癌的药物治疗提供新的思路，但找到彻底治愈肝癌药物的研究仍然任重而道远。