郑清山

作者单位： 362000 福建省泉州市中医院

杠柳毒苷属于香加皮中具有毒性的组成成分之一，患者一旦服用含有该成分的药物，通过代谢就会转化成杠柳次苷和杠柳苷元[1]。有研究表明，杠柳毒苷能够有效抑制肿瘤细胞增殖，其毒性作用强，在使用过程中超出标准用量，或者是未正确按照标准进行使用，就会诱发一系列不良反应如心室颤动、心房颤动、恶心等，主要应用在风湿、慢性充血性心力衰竭治疗中[2-3]。三七总皂苷能够维持患者血液正常循环，保护患者心脑血管，同时还可以起到显著的抗炎作用。研究表明，三七总皂苷联合杠柳毒苷配合后，能够有效降低杠柳毒苷在患者体内的毒性作用[4]。本研究通过采用液相色谱—质谱联用法对大鼠血浆中杠柳毒苷的含量进行测定，分析大鼠机体中杠柳毒苷药代动力学与三七总皂苷之间的关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器：采用由Agilent 1200型的高效液相色谱仪、Agilent 6430型三重四级杆串联质谱仪、Agilent MassHunter分析软件进行操作，由瑞士Mettler Toledo公司所提供的AX 205型十万分之一天平，Milli-Q超纯水制备仪来自于Millipore公司，3K15型高速离心机来自于美国Sigma 公司，XW-80A型旋涡混合器来自于上海沪西分析仪器厂。

1.1.2 试剂：采用杠柳毒苷和三七总皂苷、补骨脂素；补骨脂素均是由我食品药品检定研究院所提供。该产品的纯度为达到95%以上；三七总皂苷的总量均在65%以上；美国Thermo Fisher Scientific Inc公司所提供的色谱纯甲醇、色谱纯乙腈；美国ROE scientific Inc公司所提供的甲酸；天津康科德科技有限公司所提供的分析纯乙酸乙酯。超纯水自行操作。

1.1.3 动物实验及模型构建：选自健康雄性SD大鼠，SD大鼠的重量约为225 g。18只大鼠分为3组，分别为A组(给予杠柳毒苷) 、B组(杠柳毒苷联合低剂量的三七总皂苷)、C组(杠柳毒苷联合高剂量的三七总皂苷)，杠柳毒苷每天10 mg，三七总皂苷每天分别为0.74 g、2.22 g，灌胃治疗1周。

1.2 方法

1.2.1 色谱参数：色谱柱：Waters CORTECSTM C18柱,规格为2.1 mm×50 mm,2.7 μm)；流动相：B为乙腈，A为浓度为0.1%甲酸水；采用梯度洗脱方式，洗脱具体程序为：0～7 min，19%～50% B；7～9 min，50%～50% B；洗脱时间为9 min；流速需要每分钟设置为0.3 ml；柱温控制在30 ℃；进样量为5 μl。

1.2.2 质谱参数：采用电喷雾离子源，在检查过程中具体的监测方法大都是采用多反应离子，对正离子进行检测；Delta EMV(+)：500 V；干燥温度设置为：300 ℃；干燥气流速每分钟为11 L； 雾化压力为15 psi。通过采用定量分析法分析杠柳毒苷、补骨脂素，具体数值为719.4→719.4，其碎裂电压分别为135 V和115 V，碰撞能量分别为3 V和25 V。

1.2.3 溶液配制：杠柳毒苷标准溶液：采用专用的精密仪器称取杠柳毒苷10.03 mg，放置在10 ml的容量瓶中进行稀释，稀释过程中需要采用甲醇进行溶解，配制为1.003 mg/ml的储备液进行储存，储存在4 ℃的冰箱内。精密所量取的杠柳毒苷储备液，采用甲醇进行稀释，稀释成一系列的标准溶液进行备用，分别为5、10、25、50、125、500、2 000、 2 500 ng/ml。

内标溶液：量取剂量为10.01 mg的补骨脂素作为对照品，将其溶液放置在10 ml的容量瓶中进行稀释，稀释方法采用甲醇进行，成为1.001 mg/ml的储备液，之后储存在温度为4 ℃的冰箱内待用。之后再采用甲醇对补骨脂素储备液进行稀释，稀释成内标溶液，剂量为1 μg/ml，作为备用溶液。

1.2.4 样本处理：精密量取100 μl血浆样品与20 μl内标溶液、20 μl甲醇进行涡旋混合，内标溶液中包含1 μg的补骨脂素，之后再加入剂量为2 ml的乙酸乙酯，采用涡流的方式进行振荡，振荡时间5 min，14 000 r/min，离心10 min后，留取2 ml的上清液，并用氮气将其吹干，再采用100 μl浓度为50%的甲醇进行复溶，采用涡流的方式进行振荡，振荡时间5 min，14 000 r/min同样离心10 min，留取5 μl的上清液，采用液相色谱—质谱法进行分析。

2 结 果

2.1 专属性 精密量取100 μl空白血浆，之后将40 μl的甲醇加入其中，按照1.2.4项下处理，并将上清液选取一部分留下，按照正确操作流程对上清液样本进行分析，分析后将杠柳毒苷对照品溶液、内标溶液全部加入到空白血浆中，同样采用上述方式进行处理；取大鼠灌胃之后的血浆样品，依同法进行处理。杠柳毒苷保留时间控制在3.35 min，内标补骨脂素的保留时间控制在4 min左右。血浆样品中所包含的内源性成分之间不存在任何的联系。

2.2 精密度与准确度 将2、25、400 ng/ml不同浓度的杠柳毒苷对照品溶液分别加入到精密量取100 μl空白血浆中，每个浓度溶液各取6份，按照1.2.4项下进行处理，并对已经完成合理配制的溶液浓度进行测定，连续测量3 d，同时还需要与标准曲线在同一时间进行操作，操作完成后记录峰面积，并对日内精密度和日间精密度进行计算，通过计算可以直接得知：日内精密度明显高于日间精密度，具体RSD值分别为13.58%、8.87%，准确定度范围在91%～101%。

2.3 回收率与基质效应 在选择空白血浆时，为了确保研究结果的准确性和真实性，需要严格按照选择对象的方式选择，并根据样本处理的方式对空白血浆进行处理，制备2、25、400 ng/ml 3种不同浓度的血浆样品，分别设为低、中、高，不同浓度的血浆样品各留取6份，进样量为5 μl，准确记录峰面积，设为A1；在40 μl的甲醇中另外再选取100 μl的空白血浆，同样按照1.2.4项下的方法进行处理，处理后用3种不同的浓度的杠柳毒苷对照品溶液进行复溶，进样量同样为5 μl，对峰面进行准确记录，将其设为A2，其公示为R=A1/A2×100%；在同样的条件下，选取同样条件下选取3种不同的浓度的杠柳毒苷对照品溶液，记录峰面积，设为A0则基质效应为M=A2/A0。内标补骨脂素的提取回收率、基质效应计算方法与上述方法一样。结果表明，不同浓度的回收率和基质效应均符合生物样品分析和探究的标准。见表1。

表1 杠柳毒苷和内标补骨脂素在大鼠血浆中的提取回收率和基质效应

2.4 稳定性 量取大鼠100 μl的空白血浆，配制成低、中、高3种浓度，分别为2、25、400ng/ml，不同浓度溶液各取3份，并且按照1.2.4项下进行处理，分别对其室温情况进行考察，考试时间需要控制在6 h,考察完成后对相关数据进行处理，同时还需要对血浆样品进行处理，处理后将其放置在自动进样器中，放置时间控制在12 h，需要对样本反复冻融，3次后，将其放置冰箱进行储存，冰箱内的温度控制在零下70 ℃，冷冻时间需要控制在14 d。杠柳毒苷的准确度区间为93.45%～112.89%， RSD区间为1.82%～14.58%。经结果显示，杠柳毒苷在一定条件下其稳定性良好。

2.5 药动力学结果 最后1次给药需要在18只健康雄性SD大鼠禁食12 h后，在禁食的过程中可以饮水，需要在2个时间段经大鼠目内眦取血，最后1次给药前、最后1次给药后，取血任务完成后，需要将其按照放置顺序放在肝素离心管中进行备用，6 000 r/min离心10 min，留取上清液，之后将其放置在冰箱内进行储存，冰箱内的温度需要控制在零下70 ℃，指导进行样本分析。通过采用DAS 1.0软件对A、B、C组的药动学参数进行计算。采用SPSS 19.0统计学软件对此次研究的数据进行处理，利用单因素方差的方式来分析不同组别的药动学参数差异，3组Cmax、Tmax、T1/2、Ke、AUC0-t、AUC0-∞比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 不同组大鼠灌胃给药后杠柳毒苷的主要药动学参数

3 讨 论

香加皮属于临床上常用的一种中药材，其化学成分包括强心苷类、C21甾类、萜类等。如果不按照标准使用就会引发不良反应，严重影响患者病情恢复，而且在临床上也已经逐渐被淘汰。杠柳毒苷、杠柳次苷都是甲型强心苷类成分[5]。口服杠柳毒苷后，会在患者体内发生代谢性转化，以杠柳次苷的形式存在体内。杠柳次苷能够起到抑制肿瘤、强心的作用，但是与杠柳毒苷相比，细胞毒性更强。李丽等[6]研究中表明，三七总皂苷与香加皮提取物或者杠柳毒苷配伍，在临床上具有显著的应用效果，可以在提高患者临床效果的同时，降低药物所产生的不良反应，安全性高。通过本次研究对液相色谱—质谱法进行完善与优化，可以发现该分析方法具有良好的专属性，灵敏度高，线性范围广泛，具体区间为1～500 ng/ml， 并且线性关系良好，与传统的方法相比，该方法操便捷，运行的时间短[7-8]。经方法学验证后，该方法在操作、原理等多个方面上都可以满足生物样品测定过程中的需求和标准，可以采取正确的方法对杠柳毒苷含量进行测定。有研究学者表明，基于静脉注射和腹腔注射给药方法通过采用液相色谱—质谱法对大鼠血浆中杠柳毒苷和组织中杠柳毒苷的含量进行测定[9-10]。本次结果数据分析，杠柳毒苷的药代动力学具有行为规律性的特征，正因如此可直接对不同组织或同一组织的杠柳毒苷含量进行检测，其检测的准确性较高，但是在部分组织中，大部分杠柳毒苷会在1 h后被降解。在此次研究中，通过采用灌胃给药的方式，采用液相色谱—质谱法对以下指标的含量进行测定，包括杠柳毒苷含量、代谢物杠柳次苷、杠柳苷元，经测定相关数据后发现，大鼠给药后，杠柳毒苷可以短时间内被检测到，不利于药时曲线的拟定。但是在本次研究中，采用灌胃给药连续给药7 d后，通过对大鼠血浆中的杠柳毒苷含量进行检测，各个时间点的杠柳毒苷都可以直接被检测到；杠柳毒苷的药代动力学行为也会在某种特定的条件下发生一定程度上的变化，2种药物联合治疗和单独药物治疗，其Cmax、AUC0-t和AUC0-∞相对比，存在明显的差异性；另外，3组Tmax相比也存在明显的差异性。联合用药，其三七的剂量就会增大，杠柳毒苷的T1/2、AUC0-t和AUC0-∞值也会随之发生变化，呈递减趋势。在本次讨论研究中，灌胃给药的方式具有显著的临床应用价值，通过连续给药治疗，三七总皂苷可以使杠柳毒苷发生变化，从而使其代谢物杠柳毒苷的药动学行为发生明显的变化。

但本研究样本数较少，再加上实验过程中人为因素的影响会对检验效果造成影响；而且在此次研究中仅选用一种检测方法，无法保障其他检测方法的临床效果和作用，所以后期需要采集大量的研究样本，并采用不同检测方法开展临床研究，旨在为临床提供更加丰富有力的参考数据。

综上所述，通过采用操作便捷、灵敏、高效的液相色谱—质谱法能够测定大鼠体内杠柳毒苷的含量，分析大鼠体内的药动学，证明三七总皂苷与杠柳毒苷联合使用能够影响杠柳毒苷代谢产物杠柳次苷的药代动力学行为发生一定的改变。