元青苗 段玉宝*

(1.西南林业大学，云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；2.西南林业大学生物多样性保护学院，昆明，650224)

随着分子生物学的发展，更多的鸟类(Aves)mtDNA基因全序列被测定[1]，线粒体基因组作为一种研究手段在揭示鸟类的起源、系统发生[2-3]、分歧时间的研究中发挥着重要作用[4-5]。在mtDNA的13个蛋白编码基因中，COI和Cytb基因常用于动物类群的分类和系统发生关系的研究中[6-7]，具有良好的解析作用。

1 材料与方法

1.1 材料数据来源

用于研究的样品采集于云南省西北部的泸水县高黎贡山，在此区域中获得1只黄腰响蜜个体；取0.5 g左右的肌肉组织，采用无水乙醇进行浸泡，保存于西南林业大学生物多样性保护学院。其余19个物种的COI和Cytb基因序列均来自于NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库。其中，将犀鸟目(Bucerotiformes)作为外群[11]，共下载2条序列。每条COI和Cytb序列的长度分别大于650 bp和861 bp。物种信息详见表1。

表1 本研究所需的物种基因序列信息Tab.1 List and gene information of species in this study

1.2 DNA的提取、扩增及测序

从采集的肌肉组织样品中提取总线粒体DNA，DNA提取完成后加入100 μL ddH2O进行溶解，保存于-20℃的冰箱中。

线粒体基因组的引物和反应体系参照Sorenson等[12]的研究。DNA提取和PCR初步扩增完成后，经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，然后将扩增成功的产物送往上海派森诺生物科技有限公司进行测序。黄腰响蜜的线粒体全基因组信息也已提交NCBI数据库，登录号为MH737741。

2 数据处理

2.1 序列处理

在MEGA 7软件[13]中导入目标物种的序列，20条序列进行多重比对，比对好后对序列进行剪切，每条COI基因序列的最终长度均为650 bp，Cytb序列为861 bp。然后将比对剪切好的COI和Cytb序列分别整理成Fasta和Mega格式进行保存。

2.2 线粒体COI和Cytb基因的饱和性检验

运用DAMBE 5.2.63软件[14]分析所有物种的序列饱和性。如果Iss与Iss.c满足Iss

2.3 响蜜科鸟类种间遗传距离计算

在MEGA7中，选用Kimura 2-parameter模型[15]计算响蜜科响蜜属4种鸟类的种间遗传距离。

2.4 系统发育树的构建

使用贝叶斯法(bayesian inference，BI)[16]和最大似然法(maximum likelihood，ML)[16]建树。在ClustalX 1.83软件中转换整理好的序列文件的格式，保留为Nexus和Phylip格式。

构建树算法可以采用马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)算法提供所有树的验证频率。最高的后验概率树是最优解，也是最优选择的树[17]。在jModelTest 0.1.1软件[18]中算出核苷酸替代类型数(nst)、位点间速率分布(rates)等参数以及分析出研究系统发育关系最优的模型为GTR+I+G。MrBayes软件是构建BI树的常用软件[19]，该软件只支持贝叶斯法建树，所以本文运用MrBayes v3.2.1构建BI树。建树时使用4个马尔可夫链，外群则选择棕犀鸟(Buceroshydrocorax)。运行后，共进行2次run，二者相互独立，将起始的25%作为burn-in删除。运行20万代后，给出的标准误差(sd)小于0.01，则运算结束。最后，在Figtree v1.2.2中查看生成的文件。

最大似然法建树则是通过概率的计算进行的，ML系统发育树可以利用MEGA7进行构建。

2.5 分歧年代评估

使用BEAST v2.5.2软件[20-21]估算黄腰响蜜的分歧时间，此方法根据Jarvis等[11]依据鸟类化石记录对多个目的分歧时间估算的结果作为校正点，啄木鸟目和佛法僧目(Coraciiformes)的分化时间约为43 Ma，犀鸟目的分化时间发生约为58 Ma。将 “*.nxs”格式的文件用于分析，采用松弛的分子钟(relaxed clock log normal)模型，树的先验值计算选择Yule Model模型，运行1 000万代。使用Tracer v1.5评估结果的稳定性，之后再进一步分析，最终得到一个含有物种分歧时间的树文件。可在Figtree v1.2.2中查看含有黄腰响蜜分化时间的文件。

3 结果与分析

3.1 基因序列饱和性分析

通过DAMBE 5.2.63软件分析20个物种的核苷酸序列饱和性，导入Fasta格式的序列文件，COI序列分析结果显示Iss=0.191 3

此外，为了更加直观地看出核苷酸序列的饱和程度，做饱和度分析的散点图(图1A和图1B)，横坐标为F84遗传距离；纵坐标为转换Ts和颠换Tv数。图1A显示，当F84距离为0.330 8时，Ts与Tv并未相等，未出现饱和现象，则本研究所获得的COI序列可以构建系统发育树。同样地，当F84距离为0.441 8时，Ts与Tv未相等，未出现饱和现象(图1B)，则本研究所获得的Cytb序列可以构建系统发育树。

3.2 响蜜科鸟类种间遗传距离分析

表2 基于COI基因的响蜜科鸟类遗传距离Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

表2 基于COI基因的响蜜科鸟类遗传距离Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

序号No.种名Species12341鳞喉响蜜Indicator variegatus2斑响蜜Indicator maculatus0.0213小响蜜Indicator exilis0.1120.0934黄腰响蜜Indicator xanthono-tus0.1200.1200.154

表3 基于Cytb基因的响蜜科鸟类遗传距离Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

表3 基于Cytb基因的响蜜科鸟类遗传距离Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

序号No.种名Species12341鳞喉响蜜Indicator variegatus2斑响蜜Indicator maculatus0.0323小响蜜Indicator exilis0.1320.1264黄腰响蜜Indicator xanthono-tus0.1770.1780.194

3.3 系统发育树分析

利用COI(图2A)和Cytb(图2B)基因重建的BI和ML系统发育树结构显示出两种基因构建的系统树拓扑结构基本一致，具有相似的系统发育关系，以BI树的拓扑结构作为展示。据图显示，黄腰响蜜与响蜜科响蜜属聚为一大支(A：PP=0.99，BP=82；B：PP=1.00，BP=100)，与啄木鸟科互为姐妹群，并有较高的支持率(A：PP=0.97，BP=75；B：PP=0.96，BP=74)。在响蜜科内部，黄腰响蜜构成单系；在4种鸟类中，最早分化出来的类群是黄腰响蜜，其次是小响蜜(Indicatorexilis)。鳞喉响蜜(Indicatorvariegatus)与斑响蜜(Indicatormaculatus)聚为一支(A：PP=0.98，BP=91；B：PP=1.00，BP=100)。

3.4 分歧时间分析

Tracer v1.5软件中显示Ess值大于200，说明在BEAUti中设置的参数是合理的，最后得到含有物种分歧时间的树文件。响蜜科鸟类的分化时间详见图3，可知响蜜科鸟类起源于新第三纪中新世时期，距今约20.44(15.88，25.77)Ma，而黄腰响蜜也在此时间段内分化出来(20.44 Ma)。此外，在渐新世和中新世阶段，啄木鸟目鸟类的多样性不断扩大，物种多样性越来越丰富。

4 讨论

4.1 黄腰响蜜的系统发育分析

COI和Cytb基因片段序列被广泛地应用于解决鸟类的分子系统发育问题[22]。本文的结果显示，黄腰响蜜聚在响蜜科响蜜属物种所在分支里，并且有着很高的支持率。黄腰响蜜所在的响蜜科与啄木鸟科有着姐妹群的关系，这与Prum等[23]的研究结果一致。而在响蜜科内部，黄腰响蜜是最早分化出来的物种，其次是小响蜜；且黄腰响蜜无姐妹群。

4.2 黄腰响蜜的起源分化

本研究分子定时的结果显示啄木鸟科分化于14.95(14.02，15.89)Ma，与Prum等[23]的研究结果(Prum等研究表明啄木鸟科的分化时间约为15 Ma)相近，表明了分歧时间推断的合理性和准确性，进而为评估黄腰响蜜的分歧时间提供支持。响蜜科鸟类的分化可追溯到新生代新第三纪中，黄腰响蜜在新第三纪中新世阶段分化，时间节点为20.44(15.88，25.77)Ma。在这一时期，青藏高原发生了广泛的隆起(22—20 Ma)，并随着多个隆升事件[24-25]，直到3.4 Ma到1.6 Ma，高原抬升4 000 m以上，这被认为显著影响了其形貌和鸟类物种的多样化[26]。所以黄腰响蜜的形成可能与青藏高原隆起有关，其历史和地理模式受到了青藏高原及周边区域隆升的强烈影响。