董 路 何紫薇 程文杰 杨建发 代飞燕 邹丰才 杨林富

(云南农业大学动物医学院，昆明，650201)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)属于球虫亚纲，弓形体属，是一种地域分布广泛且宿主众多的重要人兽共患寄生虫，是能够感染所有温血和少数冷血动物的胞内寄生性原虫[1]。鸟类(Aves)及几乎所有的哺乳动物(Mammalia)，甚至一些水生动物都有可能成为弓形虫的中间宿主[2]。弓形虫也极易感染人(Homosapiens)，据调查显示全球约有30%的人感染弓形虫，我国人群平均阳性率为7.88%[3]。人可通过食入被弓形虫卵囊或包囊污染的食物和水源感染弓形虫[4]，或是长期与宠物粪便接触或清洁不当也会导致感染。弓形虫病的危害极大，可造成孕妇早产、流产和胎儿发育畸形等，也是免疫缺陷症患者的主要死亡原因之一。同时该病对鸟类的感染会增加周围人群感染弓形虫的风险，尤其会给禽类养殖户带来严重的经济损失，并且对生态环境也会造成潜在的危害。

红嘴鸥(Chroicocephalusridibundus)是中国内陆及沿海地区最常见的中型候鸟之一，属于鸻形目(Charadriiformes)鸥科(Laridae)鸥属，因其嘴和脚皆呈红色，故称为红嘴鸥[5-6]。红嘴鸥属“三有”保护动物。红嘴鸥每年10月下旬，分别从新疆博斯腾湖、俄罗斯西伯利亚地区的贝加尔湖、蒙古国乌布苏湖区域3条路线迁移至云南，次年3月再飞回北方[7]。迁徙至云南过冬的红嘴鸥主要食取鱼虾(占进食量的95%)，昆虫(4%)，植物性食物(1%)[8]。其在昆明比较集中的几个栖息地即滇池、翠湖公园[9]、环西桥，玉溪抚仙湖等，其栖息环境正好是老鼠、流浪猫等动物的出没频繁之地，并且在滇池周边村落还存在有散养鸡饲养的情况，这几种动物都是弓形虫传播的重要中间或终末宿主，这势必为红嘴鸥感染弓形虫提供了条件。目前，关于滇池红嘴鸥感染弓形虫的相关报道仍较少。为了解迁入云南滇池越冬的红嘴鸥弓形虫感染情况，本调查选取滇池红嘴鸥为主要研究对象，并对周边红嘴鸥栖息环境中的褐家鼠(Rattusnorvegicus)、散养土鸡(Gallusgallusdomestiaus)等动物的弓形虫感染情况进行调查研究。明确红嘴鸥弓形虫的感染时间和感染源，为迁徙候鸟弓形虫病溯源、预防、诊疗等提供参考依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

于2017—2019年，从昆明滇池共采集到红嘴鸥血液样品403份，分离得到血清386份。此外，分别从玉溪市江川县江城镇、昆明市海口镇和晋宁区晋城镇、昆阳镇采集周边环境动物样品162只，其中褐家鼠128只，散养土鸡34只，解剖取其心、肝、肺、肾、脑、肌肉等组织样品放置-20℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂

弓形虫间接血凝实验(IHA)试剂(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)、基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、dNTPs(购自大连宝生物工程有限公司)、2×TaqPCR Master Mix、rTaqDNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 间接血凝实验(IHA)检测红嘴鸥弓形虫抗体

在一次性96孔110°V型塑料反应板上进行弓形虫抗体检测，加样前在反应板上做好样品编号的标记，实验操作和结果判定标准严格按照检测说明书进行。

1.2.2 弓形虫镜检观察

将采回的褐家鼠、农户散养土鸡样本进行解剖后，分别挑取脑组织充分研磨，加入少量生理盐水。吸取约20 μL脑组织悬液滴涂在载玻片上，镜检观察是否存在弓形虫病原体。

1.2.3 巢式PCR检测弓形虫病原

1.2.3.1 全基因组DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书提取各动物全基因组DNA。并将提取的DNA 保存至-20℃备用。

1.2.3.2 巢式PCR扩增弓形虫B1基因

扩增引物参照Alfonso等[10]所报道的B1基因引物序列，并优化其扩增体系和条件，预期扩增目的片段大小为530 bp，引物序列如下：

(1)外引物

B1-F1：5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′

B1-R1：5′-ACGGATGCAGTTCCTTTCTG-3′

(2)内引物

B1-F2：5′-TCTTCCCAGACGTGGATTTC-3′

B1-R2：5′-CTCGACAATACGCTGCTTGA-3′

1.2.3.2.1 巢式PCR扩增体系及条件

在200 μL灭菌PCR管中依次加入灭菌ddH2O(第一轮、第二轮分别为9.5 μL、10.5 μL)、上游引物、下游引物各0.5 μL、2×TaqPCR Master Mix12.5 μL和模板DNA(第一轮、第二轮分别为2 μL、1 μL)，混匀后瞬时离心，PCR扩增反应总体系为25 μL。设立弓形虫RH株DNA为阳性对照模板，ddH2O为阴性对照模板。两轮PCR扩增程序参数为：94℃预变性5 min后进入循环，94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共35个循环，最后72℃终延伸7 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，取凝胶块置于紫外凝胶成像系统中观察结果。

1.2.3.2.2 PCR产物测序及序列的比对分析

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定分子大小，选取条带大小为530 bp左右的PCR产物送至生工进行测序。采用NCBI上的BLAST工具与数据库中的核苷酸序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 红嘴鸥IHA检测结果

采用IHA弓形虫血清抗体检测试剂盒，共检测滇池红嘴鸥血清样本386份。其中有44份血清检测为弓形虫抗体阳性，最高抗体效价为1∶512，总阳性率为11.40%。按迁徙时间分析，迁入3个月后(3月)阳性率略高于迁入时，为11.94%；按年龄分析，成年鸥阳性率最低，为10.73%，亚成鸥阳性率最高，为55.56%，幼鸥次之；按体重分析，体重小于250 g阳性率最低，为3.13%，体重在250—300 g的阳性率为最高，为10.94%，大于300 g的阳性率次之，为13.58%(表1)。

表1 滇池红嘴鸥弓形虫血清抗体检测总结果Tab.1 Serum antibody test results of Toxoplasma gondii infection in black-headed gulls in Dianchi Lake

续表1

2.2 弓形虫镜检观察结果

分别取出褐家鼠、散养土鸡完整脑组织研磨后作涂片，在显微镜下观察。在1只昆阳褐家鼠脑组织中发现圆形包囊结构(图1)。后经分子生物学鉴定为弓形虫包囊，包囊内可以观察到许多个密集的滋养体(缓殖子)。

2.3 巢式PCR检测结果

2.3.1 弓形虫B1基因检测结果

本实验PCR产物均扩增出大小约530 bp的目的片段，与预期目的条带相符，且阴、阳性对照正常。经上海生工测序，测序结果显示所扩增的目的DNA片段确定为弓形虫序列。B1基因巢式PCR产物电泳图见图2。

2.3.2 红嘴鸥弓形虫感染情况

检测结果显示，红嘴鸥弓形虫感染率为3.23%，栖息环境中动物所有动物弓形虫平均感染率为9.03%，其中褐家鼠感染率为17.19%，散养土鸡为47.06%。有13只红嘴鸥血液样品检测为阳性，红嘴鸥栖息环境中，晋宁晋城镇10只散养土鸡弓形虫感染率达100%，而江川江城镇散养土鸡感染率为0；晋宁两镇共22只褐家鼠检测为弓形虫阳性。阳性组织中心肝、肌肉组织检出率最高(表2)。

表2 红嘴鸥和栖息环境部分动物弓形虫感染情况汇总Tab.2 Test results of PCR based on Toxoplasma gondii B1 gene in black-headed gulls and some of the animals in habitat environment

3 讨论

3.1 红嘴鸥弓形虫流行情况分析

滇池流域由北向南共分布12个湿地，每年冬季都吸引了多种候鸟迁徙至此。据调查统计，滇池周边湿地共聚集鸟类182种，主要由游禽、鸣禽和涉禽组成，其中红嘴鸥数量最多(54.77%)，并围绕整个滇池周边湿地分布栖息[11]。Miao等[12]曾在2012—2013年，通过对滇池的659只红嘴鸥调查研究发现，其中131只红嘴鸥血清中检测出弓形虫抗体，阳性率为19.9%。李朝等[13]在2017—2018年，对186份红嘴鸥血清样本进行弓形虫抗体检测，结果显示，弓形虫抗体阳性率为11.29%，且年龄为主要感染风险因素。本调查结果显示，滇池红嘴鸥平均血清阳性率为11.40%，与Miao等[12](2013年)报道的结果相比有所降低，分析可能有以下原因：由于红嘴鸥迁徙群体庞大，数量逐年增长，该调查采集的红嘴鸥对象中未发现有佩戴脚环的红嘴鸥，由此说明，与4年前采集的红嘴鸥是同一批次的可能性极小。另一方面，可能由于气候环境变化的影响以及红嘴鸥有充足食物来源，使其自身免疫力提升，不易被感染。

3.2 红嘴鸥栖息地动物弓形虫流行情况分析

猫(Felis)、鼠(Rattus)是弓形虫重要宿主，其在弓形虫病的传播中起到关键作用。20世纪70年代，研究者们通过抗体血清学调查发现世界各地区无论是家猫还是流浪猫以及野生猫科(Felidae)动物都有潜在弓形虫感染现象[14-15]。农村猫的弓形虫感染率为44.89%，城市猫的感染率19.64%[16]。Zhang和Yan等[17-18]在2014年研究发现，中国北部和东北部地区野老鼠弓形虫感染率分别达到53.8%和23.6%。此外，鸡是弓形虫重要中间宿主之一，2010年Zhao等[19]对我国13个省共计1 173份鸡血清样品进行弓形虫循环抗原(TCA)和抗体(TCAb)检测，结果发现13个省的鸡总血清阳性率为30.36%。本调查基于弓形虫B1基因，对红嘴鸥栖息地中褐家鼠和散养土鸡感染情况调查发现，褐家鼠、散养土鸡的感染率分别为17.19%、47.06%。红嘴鸥感染率与弓形虫宿主密切联系。猫作为弓形虫重要宿主，通过粪便排出孢子化卵囊，鼠作为中间携带者可被感染，鸡、红嘴鸥等禽类可通过地面觅食，摄入被猫粪便中弓形虫卵囊污染的食物和水，从而增加了红嘴鸥感染弓形虫的几率。

3.3 红嘴鸥弓形虫感染风险分析

自1985年红嘴鸥首次大规模进入昆明主城区以后，每年都会有越来越多的红嘴鸥如期抵达昆明越冬。红嘴鸥属于群体迁徙野生候鸟，主要感染时间发生在迁徙中和迁入后。年龄是主要感染风险内因素，亚成鸟的血清抗体阳性率显著高于幼鸟和成鸟，原因可能是其处于生长发育的中间阶段，对于食物的需求量大，通过食物感染弓形虫的风险极大提高。此外，亚成鸟的机体体征处于变化较快的阶段，长途迁徙过程中易受外界环境因素的影响。

环境条件也是红嘴鸥感染的一个重要外因素。红嘴鸥主要集中在滇池周边公园、垃圾场和村寨等地觅食。而这些地方也是老鼠、猫出没之地，靠近滇池周边的村落还存在饲养散养鸡的情况；该地区的水环境可能被猫粪便中的弓形虫卵囊污染，因此大大增加了红嘴鸥弓形虫感染的风险。此外，被弓形虫卵囊污染土壤也是红嘴鸥感染弓形虫的一个重要途径。据调查显示，昆明地区猫的粪便弓形虫卵囊检出率为4%[20]，Lélu等[21]研究表明，土壤中弓形虫卵囊对于环境耐受性较高。翟凯等、杜芬等[22-24]研究发现公园、居民区等公共场所，奶牛场、猪场等养殖场地的土壤中均存在弓形虫卵囊污染。其次，迁徙途中在湿地、浅滩等捕食水中已感染弓形虫的小型蜗牛、鱼虾等也存在一定感染风险。弓形虫的卵囊在水中至少可以存活6个月[25]，一些鱼、贝类可作为弓形虫传播的载体从而浓缩水中弓形虫卵囊。杨振[26]对中国部分地区水生生物弓形虫检测发现，克氏原螯虾(Procambarusclarkii)中有弓形虫感染，阳性率0.65%，由此表明，水生生物在寄生虫的转寄作用上起到了关键作用。