吴亚江 王 晨 翟俊琼 陈 武

(广州动物园，广州市野生动物研究中心，广州，510070)

双垂鹤鸵(Casuariuscasuarius)俗称食火鸡，属于平胸总目(Ratitae)，鹤鸵目(Struthioniformes)，鹤鸵科(Casuariidae)鸟类，分布于新几内亚南部及澳大利亚北部的热带雨林中，善于奔跑跳跃，性情机敏凶猛，主要以果实为食，偶尔捕捉一些蜗牛、昆虫、小鱼、鸟及鼠类。圈养条件下，处于幼雏至亚成体时期的鹤鸵，雌雄个体之间的体型外貌差别不大，性别鉴别存在极大的困难。需要确定其性别时，必须在保定状态下翻查泄殖腔进行形态学鉴定，否则从外观来分辨鹤鸵幼雏甚至成年个体的性别是难以确定的，但鹤驼的保定是极为危险，这种操作不仅对饲养人员和动物造成极大的安全隐患，也对鹤鸵的饲养、配对和繁育造成了极大的困难。所以，需要建立一种简便、准确、非损伤性的鹤鸵性别鉴定方法。

当前国内圈养条件下的鹤鸵数量较少，能够成功繁殖的个体也是屈指可数[1-3]，主要原因是圈养鹤鸵性情比较凶猛，发情期同性之间易出现打斗，雌雄找不到合适的配对对象，造成雌雌、雄雄配对的现象。在不确定性别配对是否合适的情况下，繁殖期的营养管理与群体管理就无从谈起，导致鹤鸵即使能够顺利产卵，也会出现受精卵较少、质量差、健雏率低的情况，造成人员物质等方面很大的浪费。如果能有一种从幼雏就能鉴定其性别的方法，我们可以进行标记，提早做好配对工作，减少发情期的打斗，提高配对种鸟的量，从而提高鹤鸵的繁殖率。

鸟类的性别按照染色体的不同，雌性个体的基因型为ZW，雄性的是ZZ。目前，常用EE0.6(0.6-Eco R I-fragment)和CHD(chromo-helicase-DNA-binding gene)性别连锁基因鉴定鸟类的性别[4-7]。孙志明等[8]对白枕鹤(Grusvipio)和丹顶鹤(Grusjaponensis)CHD基因和EE0.6基因的序列进行了特异性扩增，成功地对鹤类的性别进行了鉴定。Griffiths等[5]利用CHD基因对金刚鹦鹉Psittacdae等28种非平胸鸟类进行了性别鉴定，但这种方法并不适合平胸鸟类性别鉴定。2010年付晶等[9-10]利用已报道的大量通用引物，进行18种组合，最终找到了1对验证引物和1对有效引物，成功鉴定了鸸鹋(Dromaiusnovaehollandiae)和鸵鸟(Struthiocamelus)的性别。2015年，Morinha等[11]使用高分辨率溶解曲线的方法和测序的方法，对鸵鸟、美洲鸵(Rheaamericana)、鸸鹋和南方食火鸡的4个性别鉴定候选基因(NTRK2、RASEF、TMEM2、DAPK1)进行溶解曲线分析，详细的解释了这4个基因在4种鸟类上SNP位点的不同。但这一实验方法仅是理论上说明这种方法的可行性，并没有建立具体的鉴定方法，且该实验条件要求较高、操作复杂，成本高，实用性低等，不能够推广使用，存在极大的局限性。

因此，迫切需要开发一种简单方便的鹤鸵性别鉴定方法，本研究基于RASEF基因的测序与分析，通过SNP位点对鹤鸵进行性别鉴定，建立一种鉴定鹤鸵性别的快速、准确、可靠和安全的分子生物学方法，为鹤鸵的饲养管理与繁殖提供便利。

1 研究材料

本试验共采集14只双垂鹤鸵样本，其中2019年从广东多家动物园采集6只双垂鹤鸵的样本，包括3只已知性别(2只雄鸟和1只雌鸟)和3只未知性别的个体，样本均为羽毛。另外8只未知性别的个体作为验证样本来自华东某动物园，其中4份羽毛，4份血液样品。11只未知性别鹤驼样品，根据饲养繁殖记录和形态学观察，性别为雌性个体8只，雄性为3只。

2 研究方法

2.1 基因组DNA提取

使用Blood Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)和Forensic Tissue DNA Kit(Omega Bio-Tek公司)试剂盒分别对血液和羽毛样品进行DNA的提取。将羽毛的基部剪碎或取10 μL血液放入1.5 mL Eppendorf 离心管中，按照试剂盒的提取方法和步骤完成基因组DNA的提取。取适量的总DNA，使用7415 Nano超微量分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度，将基因组DNA保存在-20℃冰箱，备用。

2.2 传统方法实验测试

2.2.1 引物设计

文献[8-9]中选取已报道的4对(EE0.6/1272、P9/P14、P2/P8和2550F/2718)鸟类性别鉴定的通用引物(表1)。其中EE0.6/1272作为验证引物，对鹤鸵性别进行鉴定；P2/P8、P9/P14和2550F/2718是有效引物，检测提取的鹤驼DNA是否为有效DNA。

2.2.2 PCR扩增与检测

以羽毛和血液中提取的DNA为模板，以EE0.6/1272、P9/P14和2550F/2718R为引物进行PCR反应，扩增反应在BIO-RAD T100TMPCR 仪上进行。引物PCR扩增体系：扩增总体积为50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、RASEF-F1 5 μL、RASEF-R1 5 μL 、DNA模板5 μL。阴性对照中加5 μL的ddH2O，其余试剂不变。

EE0.6/1272、 P2/P8、2550F/2718R反应程序及条件均按照文献中为标准。

P9/P14反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；47.0℃ 40 s；72℃ 1 min，35个循环；72℃，10 min。

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用紫外线投射分析仪凝胶成像系统检测扩增结果。

2.3 新方法实验设计与验证

2.3.1 引物设计

选取文献中最新的研究报道中RASEF基因作为靶基因[11]，将用文献中双垂鹤鸵的序列，在NCBI中BLAST，得到平胸目鸟类鸵鸟南非亚种(Struthiocamelusaustralis)和褐几维鸟北岛亚种(Apteryxaustralismantelli)的基因组组装的同源序列(NCBI登录号：JJRT01061438.1和LK107340.1)。通过同源序列的保守区域进行引物设计，设计的引物见表1。

表1 RASEF基因引物序列Tab.1 Primer sequence of RASEF gene

2.3.2 目的基因 PCR扩增

设计的引物反应体系和条件如下：扩增反应在BIO-RAD T100TMPCR 仪上进行。引物PCR扩增体系：扩增总体积为50 μL，其中Premix ExTaq20 μL、ddH2O 15 μL、上下游引物(10 pmol/L)各5 μL、DNA模板5 μL。阴性对照中加5 μL的ddH2O，其余试剂不变。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；49℃退火1 min；72℃延伸1 min，35个循环；72℃再延伸10 min。利用1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物，然后送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

2.3.3 退火温度优化实验

以上述提取的DNA为模板进行PCR，设退火温度分别为49.0℃、47.0℃、46.0℃、45.0℃，其他条件及体系维持不变，扩增后利用1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物，确定最佳退火温度。

2.3.4 灵敏性测试

用7415 Nano超微量分光光度计分别检测羽毛和血液提取的基因组DNA的浓度，血液DNA的初始浓度在80—100 ng/μL，羽毛DNA的初始浓度在15—20 ng/μL，对80 ng/μL的样品以0、5、25、125倍分别稀释到80 ng/μL、3.2 ng/μL、0.64 ng/μL，并以各自浓度为模板进行PCR，扩增后利用1.5%琼脂糖凝胶检测PCR产物，观察测试结果。

2.3.5 序列处理

3730xl(ABI)测序仪双向测序，利用DNAStar v 7.1.0软件包(DNASTARlnc，Madison，WI，USA)中的Seqman程序对测序结果进行正反链手工校正，所有的核苷酸位点均无杂峰。在序列中，如果存在明显由于测序问题造成的碱基错误，为确保结果的准确性需重新对其测定。序列经过校对无误后，利用SeqMan中的“存成一致序列(save consensus)”选项中“Single file”命令，根据样品信息重新命名，将正反链存成fas，aqd和seq 3种形式的文件，完成序列的拼接和手工校对。最后，比对分析序列中的SNP位点。

3 结果分析

1对验证引物(EE0.6/1272)和3对有效引物(P2/P8、P9/P14和2550F/2718)对已知性别中的雌雄2只鹤鸵进行PCR检测，琼脂糖凝胶结果表明：3对验证引物中，P9/P14出现条带，P2/P8和2550F/2718均无条带(图1)，1对有效引物雌雄都出现多条电泳条带(图2)。实验结果说明，利用1对验证引物和1对有效引物性别检测的方法无法鉴定鹤鸵的性别。

我们使用本实验新设计的引物检测14只鹤鸵，PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳(图3)。结果显示，此引物通过PCR成功扩增14只鹤鸵的样本，扩增条带单一，条带大小符合预期，约为300 bp(图3)。退火温度测试显示，在45—49℃均能扩增出目的大小条带，而在退火温度为49.0℃扩增条带最明亮；浓度为 80 ng/μL 的DNA为模板，以5倍依次稀释，PCR均出现目的条带(图5)，稀释0倍时条带最亮，亮度随着浓度降低而减弱。

对鹤鸵的PCR产物进行双向测序，结果发现使用反向引物RASEF-R1的测序结果由于存在插入缺失而出现大量双峰，而使用正向引物RASEF-F1的测序结果序列峰值较好，可以作为后期分析资料。通过比较采自广东某些动物园的3只已知性别个体的序列，发现雄性个体在扩增RASEF基因序列的第119位点、157位点和162位点分别为G/G、T/T、C/C，而雌性个体在这3个位点均为杂合子A/G、T/G、C/T。由于鸟类的雄性染色体是ZZ，雌性染色体为ZW，所以雄性个体在这3个位点呈现单一的碱基峰值，而雌性个体的这3个位点的碱基为杂合子，测序结果在该位点中出现双峰(图6)。

我们对验证组中未知性别的11只鹤鸵样本进行鉴定，根据测序结果判定为2只雄性和9只雌性，结果与动物园后续提供的形态学鉴定信息相一致。因此，我们的实验结果可以准确地对未知性别的鹤鸵样品进行性别鉴定。

4 讨论

目前，从外观无法鉴定性别的鸟类，通常采用分子生物学的方法筛选性染色体基因组上的非同源区域，然后进行PCR特异性扩增，用琼脂糖凝胶检测条带的方法来鉴定鸟类的性别，电泳结果呈现2条带的为雌性，1条带的是雄性，或者电泳结果呈现1条带的为雌性，无条带的是雄性。鹦鹉(Psittaculaspp.)、丹顶鹤与雀类等鸟类的性别鉴定方法都是基于EE0.6和CHD基因的同源性序列来开发的。

迄今为止，关于鹤鸵的非保定状态下简易可靠的性别鉴定方法极少。因此，建立一种简单、便捷、无损且对鹤鸵伤害较小的性别鉴定方法非常迫切。本研究中，由于RASEF基因短小，存在连锁变异位点，测序简单，我们把RASEF基因作为靶向基因，选取其他平胸总目鸟类的RASEF基因的同源序列设计引物，进行PCR及测序。RASEF基因序列显示，雄性所有位点的碱基均为单一峰值；雌性个体中，有3个位点(119、157和162)均为杂合子(图5)，利用该基因在性染色体中SNP位点上的差异检测个体的性别。我们对14只采自不同动物园的鹤鸟羽毛或组织利用该方法进行鉴定，其结果与后续形态学分析一致，说明该方法结果可靠。同时，做最适退火温度试验时，发现各退火温度均能扩增出目的条带，说明该引物对退火温度要求不高，适用的温度范围较广；敏感性试验结果显示4种不同浓度均能有效扩增出目的条带，也表明该引物敏感性高，对试验样品采集的量要求不高。

本研究打破传统利用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带数量来确定性的实验方法，利用正向测序的SNP位点变化情况来确定鹤鸵的性别，鉴定结果与付晶等[9-10]实验方法相比，无杂带、错峰等现象，鉴定结果更可靠。基于RASEF对鹤鸵进行性别鉴定的方法，具有成本小、不用捕捉动物、灵敏度较高，仅需采集少量羽毛、对动物没有任何损伤、鉴定快速等优点，检测的准确率极高，是一种较理想的鹤鸵性别鉴定方法。未来可以在此基础上进一步开发荧光定量PCR的检测方法，减少测序的过程，可以获得更简便快捷的效果，为以后平胸鸟类性别鉴定的研究提供了新的技术方法和研究方向。