曲凤仪 孙婷庭 刘书玉 赵振良 薛 原

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

大肠杆菌(Escherichiacoli)作为一种条件性致病菌，在多种因素引起的机体免疫力下降时可引发机体感染，更是导致动物腹泻的众多原因之一[1]。在大肠杆菌的强毒力菌株中，编码irp1、irp2、fyuA、ybtA等多种毒力基因的耶尔森菌强毒力岛(high island，HPI)和编码eae等基因的致病性肠细胞脱落位点毒力岛(locus of enterocyte effacement pathogenicity island，LEE)经常出现，这些强毒力菌株感染可引起狐(Vulpesvulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)等毛皮动物死亡。此外，大肠杆菌黏附素的合成也与其致病性有密切联系[1-4]。

本研究采用了PCR 技术[1]对东北地区貉养殖场的56株大肠杆菌进行了irp1、irp2、fyuA、ybtA、eae、iucD、fimH、stx1、stx2、iss10种毒力基因的检测，以获取各毒力基因存在频率的大小，为之后大肠杆菌所致流行病的研究与防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 细菌菌株

本实验分离鉴定了东北地区3个貉养殖场的大肠杆菌菌株，共计56株。

1.2 主要试剂

琼脂糖，10×Loading Buffer，DNTP，TaqDNA聚合酶，I型核酸染色剂，DL2000 DNA maker等均购自宝生物技术有限公司。

1.3 引物设计

按照参考文献[1，5-6]设计引物序列iucD，irp2，fyuA，fimH，iss，stx1，ybtA，irp1，stx2，eae。

1.4 PCR扩增

反应体系为18 μL去离子水，2.5 μL 10×Loading Buffer，2.0 μL DNTP，0.5 μL上下游引物，0.25 μLTaqDNA聚合酶，2 μL菌液。

表1 大肠杆菌毒力基因的引物Tab.1 Primers for E.coli virulence genes

2 结果

2.1 貉源大肠杆菌单个毒力基因检测

对58株貉源大肠杆菌进行PCR检测：共22株检出iucD，阳性率为39.29%；21株检出irp2，阳性率为37.50%；30株检出fyuA，阳性率为53.57%；54株检出fimH，阳性率为98.21%；3株检出ybtA，阳性率为5.36%；其中，相关黏附基因iss，stx1，stx2，irp1在58株貉源大肠杆菌中均无检出。

2.2 貉源大肠杆菌多个毒力基因的检出结果

由表2可知，iucD、irp2、fyuA与irp2、fyuA、fimH、ybtA以及iucD、irp2、fyuA、fimH、ybtA分别同为阳性的菌株均有1株，分别占1.79%；irp2、fimH与fyuA、fimH同为阳性的菌株均有3株，占5.36%；iucD、irp2、fyuA、fimH分别同为阳性的菌株均有4株，占7.14%；iucD、fimH同为阳性的菌株有5株，占8.93%；iucD、fyuA、fimH同为阳性的菌株有6株，占10.71%；irp2、fyuA、fimH同为阳性的菌株有9株，分别占16.07%；未发现有同时携带5个以上毒力基因的菌株。

表2 毒力基因检测结果统计Tab.2 Virulence gene test results statistic

3 讨论

大肠杆菌作为一种条件性致病菌，能够引起人与动物的肠道性疾病，其致病性与黏附素、紧密素和肠毒素等多种毒力因子有关。

此次检测中iucD、irp2、fyuA、ybtA基因由于地区的不同，检出率也有较大差异。iucD基因在h地区共检出10株，阳性率为33.33%，在G地区共检出12株，阳性率为46.15%；irp2基因在h地区共检出9株，阳性率为30%，在G地区共检出12株，阳性率为46.15%；fyuA基因在h地区共检出10株，阳性率为33.33%，在G地区共检出20株，阳性率为76.92%；ybtA基因在h地区共检出3株，阳性率为10%，在G区并未检测出携带菌株，阳性率为0%。由此显示，不同地区的不同动物甚至相同动物所携带的E.coli基因型有所差异[7]。且根据 Wang 等[8]的研究，大肠杆菌菌株的致病性与毒力相关基因的数量和组合模式密切相关，可以进一步研究。

耶尔森菌HPI最早发现于耶尔森菌属(Yersinia)，研究表明其在多种肠杆菌属的细菌中均有存在，而且可以在耶尔森氏菌(Yersiniavanloghem)和E.coli之间水平传播，与致病性E.coli的毒力进化密切相关，一些E.coli携带的irp2、fyuA序列与耶尔森氏菌的几乎相同[9]。irp2与fyuA作HPI毒力岛的主要组成成分，常作为基因检测的标志性基因。在此次试验中，这两种基因的检出率较高，然而根据Hu等[10]研究，携带fyuA基因无法保证HPI核心功能区的完整性，而完整的HPI毒力岛核心功能区也并不保证功能性耶尔森菌素的合成[11]。fyuA基因作为HPI的核心基因之一，其编码产物可以增强大肠杆菌对于铁的摄取能力以及生物膜的形成，提高大肠杆菌在动物体内逃避免疫机能的能力。

Ⅰ型菌毛中fimH亚单位作为Ⅰ型菌毛的主要组成部分，在介导细菌黏附宿主细胞的同时，为进一步侵入机体创造条件。研究表明，fimH能够与甘露糖结合发生凝集，但在D-甘露糖存在的情况下，该凝集性会被抑制。因此，表达Ⅰ型菌毛的细菌能够黏附多种细胞，如上皮细胞、巨噬细胞、红细胞等[12]。本次实验结果显示fimH的检出率高达98.21%，同样，在赵李祥[13]的研究中fimH检出率也非常高，达到 90%以上。在钟杏好等[14]的研究中，fimH检出率也高达87.1%—91.3%，与本实验结果一致，而fimH检出率普遍很高，这是否说明这个基因比较稳定，以及其在大肠杆菌的生存与定植过程中是否发挥着不可或缺的作用，是否所有有定植能力的大肠杆菌都有这种毒力基因，种种问题还有待进一步验证[1]。同时，此实验中并未检测出仅携带irp2、fyuA基因的菌株，但检测出了fimH与irp2，fimH与fyuA；未检测出iucD、eae基因的菌株，却检测出了fimH与iucD，fimH与eae；并未检测出iucD、fyuA基因的菌株，反而检测出了fimH与iucD，fimH与fyuA。这种现象是否出于偶然，是否说明了fimH存在着其他的功能还需进一步研究。

血清耐受基因(increased serum survival gene，iss)是决定APEC致病因素之一，iss基因存在于ColV质粒上，编码的蛋白iss属于外膜蛋白的一部分，与细菌抗补体作用有关，而补体抗性又与毒力高度相关，是重要的致病因素[15]。然而此次实验中的检出率为0%，与 Ewers 等[16]的 82.7%有出入，Bonnet 等[17]认为iss为禽致病性大肠杆菌的标志基因之一，而在本次实验中iss毒力基因并未检出，是否说明本次检测的貉源大肠杆菌中不含有iss致病基因还有待进一步研究。

研究表明，大量的菌株可形成一个重要的毒力基因库，在某些情况下，并与其他因素结合，可能会产生新的致病菌株[1，4，18]。定时对动物饲养场的大肠杆菌进行毒力基因检测与分析有利于掌握疾病流行现状，为疾病的防控与治疗提供数据支撑。