杨德全 鞠厚斌 朱九超 葛菲菲杨显超 李 鑫 沈海潇 赵洪进 王 建

(上海市动物疫病预防控制中心，上海，201103)

冠状病毒(Coronavirus)属于巢状病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)，为一种正义单链RNA病毒，根据其基因组结构及系统发生学分析，可分为α、β、γ和δ 4个属。α和β属冠状病毒可感染哺乳动物，而γ和δ属冠状病毒主要感染鸟类，少数也可感染哺乳动物[1]。冠状病毒有十分广泛的宿主种类，人(Homosapiens)、猪(Sus)、马(Equuscaballus)、牛(Bos)、鼠(Rattus)、犬(Canis)、猫科(Felidae)动物等，可通过不同机制进行跨种传播[2]。新型冠状病毒性肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)疫情发生以来，人与动物的安全已成为当今社会的公共卫生大事之一。现有研究表明，新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)来源于某种或某几种野生动物[3-4]。为了及时了解猫科动物感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)的情况，本研究采集上海某动物园的猫科动物样品进行冠状病毒检测，不仅可以了解冠状病毒在猫科动物的感染情况，而且对公共卫生及野生动物保护具有重要意义。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒亚科β属 B 亚群，其基因组具有典型的冠状病毒结构，基因组序列与蝙蝠源的冠状病毒同源性高达96%[5]。猫冠状病毒(FCoV)属于冠状病毒亚科α属，其基因组由1条长约29 000核苷酸的正链RNA组成。编码11个开放阅读框(ORFs)：2个复制酶蛋白基因(pp1a和pp1ab)、4个结构蛋白基因(S、E、M和N)和5个附属蛋白基因(ORF3a-c和ORF7a，b)[6]。FCoV 可分为type I 和type Ⅱ两种血清型；猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，FIPV)两种生物型，两种血清型在两种生物型中普遍存在[6]。FECV致病性低，引起轻度肠炎或无明显感染；FIPV毒力强，致死性强。本研究对检测到的3个阳性肛拭子样品进行FCoVORF3、ORF7和S基因检测和遗传进化性分析，旨在从分子水平揭示其是否具有致病性，并为猫科动物的保护提供科学建议。

1 材料与方法

1.1 样品

2019年12月至2020年1月，收集来自上海某动物园的猫科动物样品144份，包括捕捉的野猫(Felissilvestris)、华南虎(Pantheratigrisamoyensis)、美洲狮(Pumaconcolor)、豹(Pantherapardus)、豹猫(Prionailurusbengalensis)、狞猫(Caracalcaracal)、薮猫(Leptailurusserval)、猞猁(Lynxlynx)等动物的鼻拭子、肛拭子、粪便样品(表1)。将样品-80℃冰箱中保存，备用。

表1 冠状病毒荧光RT-PCR检测结果Tab.1 Results of detection of coronavirus by real-time PCR

1.2 主要试剂

病毒RNA 提取试剂盒购自上海美吉生物医药科技有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)、DNA 纯化回收试剂盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 Marker和EscherichiacoliDH5α Competent Cells，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3 RNA 的提取

用PBS将粪便以1∶5比例稀释，混匀后反复冻融3次，8 000 r/min 离心10 min。参照病毒RNA 提取试剂盒说明书，提取样品中病毒RNA。

1.4 冠状病毒荧光RT-PCR检测

SARS-CoV-2 按照新型冠状病毒荧光RT-PCR试剂盒说明书进行检测；FCoV 按照本实验室建立的荧光RT-PCR 方法进行检测。

1.5 ORF3、ORF7和 S2基因序列的扩增

参照文献[7]合成FCoVORF3、ORF7和S2基因的PCR 引物，以1.3 获得RNA 为模板分别利用一步法试剂PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)进行RT-PCR 扩增。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性扩增产物电泳切胶后，按照DNA 纯化回收试剂盒说明书进行胶回收纯化，将回收纯化产物与pGM-T 载体连接，阳性质粒送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.6 ORF3、ORF7 和S2基因序列的分析及进化树构建

应用DNAStar 7.0 软件的MegAlign 程序对测序获得的序列进行同源性比对。应用NCBI 检索同源序列，使用MEGA 5.05 软件中邻接法(neighbor-joining)构建遗传进化树，并用Bootstrap 方法重复1 000 次进行检验，其他参数使用默认值。

2 结果

2.1 冠状病毒检测情况

从2019年12月到2020年1月，共检测猫科动物样品144份，结果详见表1。SARS-CoV-2荧光RT-PCR 检测全部为阴性；FCoV 荧光RT-PCR 检测阳性3份，其中野猫肛拭子1份，命名为SH1951；豹猫粪便阳性2份，分别命名为SH2003和SH2004。

2.2 FCoV 部分基因的测序结果

利用PCR 对SH1951、SH2003和SH2004 3个阳性样品进行FCoVORF3、ORF7和S2基因进行扩增，将所扩增出的特异性目的片段进行克隆和测序，将所测序列递交至GenBank，获得的序列登录号：MT112938—MT112946。

2.3 ORF3 的序列分析

SH1951、SH2003和SH2004 3个样品扩增得到的FCoV 的ORF3a基因的总长度为213 nt，均编码70 aa，与血清Ⅰ型毒株编码的氨基酸长度一致。它们之间核苷酸同源性为96.2%—100.0%，氨基酸同源性为93.0%—100.0%，其中SH2003与SH2004核苷酸和氨基酸同源性均为100%。SH1951、SH2003和SH2004均与国内毒株HLJ/DQ/2016/01同源性最高，分别为94.4%、95.3%和95.3%；它们分别与Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性为93.0%、93.9%和93.9%，与Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性均为70.4%。

SH1951、SH2003和SH2004 3个样品病毒的ORF3b基因的核苷酸存在突变，但不引起编码氨基酸数量(73 aa)的改变，均与血清Ⅰ型毒株(除Black和FCoV C1Je外)编码的氨基酸长度一致。它们之间核苷酸同源性为88.3%—99.1%，氨基酸同源性为90.5%—100.0%。SH1951、SH2003和SH2004分别与Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性为92.8%、89.6%和88.7%，与Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性为68.5%、67.1%和67.1%。SH1951、SH2003和SH2004与Black和FCoV C1Je之间核苷酸同源性为78.8%—89.2%，氨基酸同源性为52.1%—88.7%。

SH2003和SH2004的ORF3c基因与大多数血清Ⅰ型非截短ORF3c基因一样，由714 nt组成，编码237 aa，而SH1951存在着连续6个碱基的插入，编码239 aa。它们之间核苷酸同源性为95.5%—99.0%，氨基酸同源性为93.7%—98.7%。SH1951、SH2003和SH2004分别与Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性为95.4%、95.2%和95.4%，与Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性为86.2%、87.4%和87.5%。

根据获得的3c基因序列和GenBank 中FCoV3c基因的参考序列构建系统发育树(图1)，其中SH1951、SH2003和SH2004处于同一遗传进化分支，并与血清Ⅰ型国内外毒株均处于同一大的遗传进化分支。与血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i处于不同分支，亲缘关系较远。

2.4 ORF7的序列分析

SH1951、SH2003和SH2004 3个样品扩增得到的FCoV 的ORF7a基因的总长度为306 nt，均编码101 aa，与血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株编码的氨基酸长度一致。它们之间核苷酸同源性为94.4%—100%，氨基酸同源性为98.0%—100.0%。SH1951、SH2003和SH2004分别与Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性为92.5%、95.8%和95.8%，与Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性为93.8%、94.8%和94.8%。SH1951、SH2003和SH2004的ORF7a的第9、12位和47位分别为苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)和丝氨酸(S)，见图2。

SH1951、SH2003和SH2004 3个样品扩增得到的FCoV 的ORF7b基因编码一个由206 aa组成的蛋白质，与血清Ⅰ型(Black除外)和Ⅱ型毒株编码的氨基酸长度一致。与参考序列相比，它们有多个位点发生氨基酸的变化，但它们在第170位的氨基酸均为H。它们之间核苷酸同源性为89.7%—98.9%，氨基酸同源性为86.0%—96.6%。SH1951、SH2003和SH2004分别与Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性为91.5%、91.6%和91.1%，与Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性为89.2%、90.3%和89.9%。

根据获得的7b基因序列和GenBank 中FCoV7b基因的参考序列构建系统发育树(图3)，其中SH1951与UG-FH8亲缘关系最近，与大部分血清Ⅰ型毒株和血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i毒株均处于同一大的遗传进化分支。而SH2003和SH2004处于另一大的遗传进化分支，并与HLJ/HRB/2016/1的亲缘关系最近。

2.5 S2的序列分析

本实验所得SH1951、SH2003和SH2004 3个样品扩增得到的S2基因的序列之间核苷酸同源性为90.1%—99.5%，氨基酸同源性为94.2%—99.3%。它们与参考株的相应核苷酸相似性为65.1%—90.9%，氨基酸相似性为61.5%—96.2%。SH1951、SH2003和SH2004 的S1/S2裂解位点处有连续的R-R-S/A-R-R-S序列模体(图4A)，符合FECV裂解位点的氨基酸序列特征[8]。与国外UU-FH8等毒株和国内黑龙江的4个毒株相比，在第1 045位(M)、1 047位(S)和1 108位(D)均没有发生氨基酸的完全替换(图4B)。

根据获得的S2基因序列和GenBank 中FCoVS基因的参考序列构建系统发育树(图5)，其中SH1951、SH2003和SH2004处于同一遗传进化分支，并与HLJ/DQ/2016/01和UG-FH8亲缘关系最近，与其他血清Ⅰ型毒株均处于同一大的遗传进化分支。与血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i处于不同分支，亲缘关系较远。

3 讨论

本研究对动物园中的猫科野生动物及野猫进行了冠状病毒的荧光RT-PCR 检测，结果显示SARS-CoV-2 全为阴性，表明猫科野生动物自身未携带或未感染SARS-CoV-2。据最新报道，香港一患者家中的宠物犬感染新型冠状病毒[9]，这提示我们应做好野生动物的保护工作，警惕人或其他动物(流浪犬、野猫等)传染给动物园中的野生动物。

研究结果显示检测到3份FCoV，其中2份来自于豹猫，1份来自于动物园中捕获的野猫，这些动物均为健康动物，无腹水等FIPV的特征症状，据此推测检测到的FCoV可能为生物型FECV。研究表明，所有FECV中的ORF3c基因均是完整的，完整的ORF3c基因被认为是FECV 在肠道中有效复制所必需的，但对FIPV 的复制则是非必需的[10]。本研究中的SH1951样品为野猫的肛拭子，虽然ORF3c基因存在着连续6个碱基的插入，但不存在截短突变，从基因上推测SH1951可能为FECV生物型。而SH2003和SH2004 均为豹猫的粪便样品，且2个病毒的ORF3c基因均为完整的3c基因，从基因上推测SH2003和SH2004为FECV生物型。据报道，在118个I 型FIPV中，95.8%的FIPV显示S基因中有M1058L或S1060A[以C1Je(DQ848678)为参考毒株]，即M1045L或S1047A[以Black(EU186072)为参考毒株]的突变，而183个FECV样本中没有发生突变。这两个氨基酸位点的差异，可用于鉴别诊断FIPV和FECV两个生物型[11]。3株病毒在第1 045位、1 047位的氨基酸均没有替换，这更进一步证明这3株病毒均为FECV生物型。

研究认为，3c和S基因的突变与FIP的发生有关[7]。而本研究中的3株病毒3c和S基因均未发生突变；且S1/S2位点的模体序列R-R-S/A-R-R-S均符合FECV裂解位点的氨基酸序列特征，比FIPV在该区域表现出高度的保守，与报道的一致[8]。表明这3株病毒均为致病性低的FECV。

从基因测序结果上看，SH2003和SH2004在核苷酸和氨基酸的同源性均非常高，而与SH1951的同源性均较高，表明豹猫携带的FECV与野猫携带的FECV为不同的流行毒株。遗传进化分析结果表明，基于ORF3c和S2基因的进化树可以分成2个主要分支，即以Black为代表的血清型Ⅰ型毒株进化分支和以FIPV 79-1146为代表的血清Ⅱ型毒株进化分支。本研究中的3株病毒与血清型Ⅰ型毒株的亲缘关系最近。而基于ORF7b基因的进化树也分成2个主要分支，SH1951与SH2003和SH2004处于不同的遗传进化分支，表明它们之间的亲缘关系较远。由于豹猫为半封闭式圈养，易和野猫接触，加上野猫生活环境复杂，自身携带的病毒种类较多，提醒我们需要加强对野猫的管理与监测，防止野猫携带的FECV或其他病毒传染给豹猫，这对保护野生动物具有重要意义。