柯蕊，和平，吴媛媛，张永红，张伟，刘原

西安交通大学第二附属医院，西安710004

肺动脉高压（PH）是一类常见肺血管疾病，表现为静息状态下肺动脉压力升高，同时合并不同程度右心功能衰竭。PH在全球发病率为1%，在年龄超过65岁的人群中可达10%，严重危害人类健康［1］。目前临床上治疗PH的靶向药物不良反应多、治疗费用昂贵，导致患者治疗依从性降低，给PH的治疗带来挑战。白藜芦醇（RES）是一种植物来源的多酚化合物和植物雌激素，在防治肿瘤及血管增殖性疾病中具有重要研究价值［2-3］。在PH的研究中也发现，RES可抑制肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖，降低动物模型的肺动脉压力并逆转肺血管重塑，提示RES可能成为PH治疗的潜在药物［4-5］。RES是沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）的天然激活剂［6］。SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，能够去乙酰化组蛋白和多种转录因子，参与DNA损伤修复、氧化应激及细胞衰老、凋亡和增殖等过程的调控［7］。研究发现，SIRT1可上调叉头蛋白O3a（FOXO3a）表达，并通过促进FOXO3a乙酰化增强其转录活性［8-9］。而FOXO3a可促进细胞周期抑制蛋白如p27的表达，使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制多种肿瘤细胞增殖［10-11］。然而，RES是否能激活SIRT1/FOXO3a/p27信号通路发挥抑制PASMC增殖的作用，目前尚未见报道。5-羟色胺（5-HT）是一种重要的促细胞有丝分裂原，我们前期研究已发现1 μmol/L 5-HT可明显刺激PASMC增殖［12］。2020年3月—8月，我们通过1 μmol/L 5-HT刺激原代PASMC增殖，探讨RES是否可通过激活SIRT1/FOXO3a/p27信号通路发挥抑制PASMC增殖的作用，以期为防治肺血管重塑及PH提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SD大鼠由西安交通大学医学部实验动物中心提供；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco公司；5-HT、SIRT1抑制剂EX527、FOXO3a抑制剂AS1842856购自美国Sigma公司；RES购自上海梯希爱化成工业发展有限公司；BrdU细胞增殖检测试剂盒购自上海麦约尔生物技术有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；大鼠p27 siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗购自英国Abcam公司；FITC标记的山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术公司；兔抗大鼠SIRT1、FOXO3a、p27单克隆抗体购自美国CST公司；兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体、HRP标记抗兔二抗购自美国Sigma公司。

1.2 原代大鼠PASMC的培养与鉴定 取健康SD大鼠2只，体质量70～80 g；腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取出大鼠心脏和肺脏组织，采用组织贴块法培养原代PASMC。应用抗α-SMA免疫荧光染色鉴定其纯度，血管平滑肌细胞纯度≥90%，可用于实验研究。

1.3 RES对PASMC增殖抑制作用观察及作用浓度筛选 取第3～6代处于对数生长期的PASMC，以2.5×104/mL接种96孔板，在37℃下贴壁24 h，1%FBS-DMEM培养基饥饿过夜，使细胞生长同步化，更换10%FBS-DMEM培养基，将PASMCs分为对照组、5-HT刺激组、不同浓度RES干预组。不同浓度RES干预组在加入1 μmol/L 5-HT前用不同浓度RES（10、30、100、300 μmol/L）预处理1 h，5-HT刺激组仅加1 μmol/L 5-HT，对照组不处理，每组设6个复孔。作用24 h后，采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况。终止细胞培养前8 h加入BrdU继续培养，随后固定细胞、变性DNA、清洗细胞；加入BrdU抗体培养细胞，再次清洗细胞后加入辣根过氧化物酶标记的二抗培养；清洗细胞后加入TMB底物显色，加入反应终止液后用多功能酶标仪在370 nm波长处读取光密度（OD），计算细胞增殖率。增殖率=（干预组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。选取与5-HT刺激组比较，首次出现统计学差异的RES干预组的浓度作为后续实验的RES作用浓度。

1.4 SIRT1/FOXO3a/p27信号通路在RES抑制PASMC增殖中的作用观察

1.4.1 SIRT1、FOXO3a、p27在RES抑制PASMC增殖中的作用观察 取第3～6代处于对数生长期的PASMC，以2.5×104/mL接种96孔板，37℃贴壁24 h；1%FBS-DMEM培养基饥饿过夜，使细胞生长同步化；更换10%FBS-DMEM培养基，将PASMCs分为对照组、5-HT刺激组、RES干预组、RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组、RES+p27 siRNA转染组。对照组不处理，5-HT刺激组仅加1 μmol/L 5-HT，RES干预组在加入1 μmol/L 5-HT前用1.3筛选的RES浓度预处理1 h，RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组在加入1 μmol/L 5-HT前用RES分别联合1 μmol/L EX527、AS1842856预处理1 h，RES+p27 siRNA转染组在加入1 μmol/L 5-HT前预先转染p27 siRNA 24 h后联合RES。取各组作用24 h的细胞，采用BrdU掺入法检测细胞增殖情况，方法同1.3。

1.4.2 SIRT1/FOXO3a在RES影响FOXO3a、p27蛋白/p27蛋白表达中的作用观察 取第3～6代处于对数生长期的PASMC，以（1～2）×105/mL接种6孔板，细胞生长至70%～80%融合后的处理同1.4.1；将细胞分为对照组、5-HT刺激组、RES干预组、RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组，细胞处理同1.4.1；作用24 h后，采用Western blotting法检测对照组、5-HT刺激组、RES干预组、RES+SIRT1抑制剂干预组的FOXO3a、p27蛋白及RES+FOXO3a抑制剂干预组的p27蛋白。蛋白质经SDS-PAGE电泳分离后，转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h；加入稀释后的FOXO3a及p27一抗，4℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，室温下孵育2 h；ECL显色，采用Bio-Rad成像系统检测条带，采集图像，采用Quantity One软件进行定量分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。所有数据以-x±s表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两组间比较用Tukey post-hoc检验，重复测量数据行重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RES对PASMC增殖抑制作用及作用浓度筛选结果 5-HT刺激组PASMC增殖率为163.28%±14.25%，高于对照组的100.00% ±16.23%（P＜0.05）。10、30 μmol/L RES干预组PASMC增殖率分别为153.11% ±13.24%、142.07% ±20.73%，与5-HT刺激组比较差异无统计学意义。100、300 μmol/L RES干预组PASMC增殖率分别为135.53%±14.77%、128.18% ±13.52%，均低于5-HT刺激组（P均＜0.05），故以100 μmol/L作为后续实验中RES干预的作用浓度。

2.2 SIRT1、FOXO3a、p27在RES抑制PASMC增殖中的作用 5-HT刺激组PASMC增殖率为165.19%±14.35%，高于对照组的100.00% ±14.66%（P＜0.05）；RES干预组PASMC增殖率为135.83% ±12.33%，低于5-HT刺激组（P＜0.05）；RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组、RES+p27 siRNA转染组ASMC增殖率分别为158.99%±10.58%、153.03% ±13.30%、156.11% ±10.25%，高于RES干预组（P均＜0.05），三组间差异无统计学意义。

2.3 SIRT1/FOXO3a在 RES影响 FOXO3a、p27蛋白/p27蛋白表达中的作用 5-HT刺激组PASMC中FOXO3a、p27蛋白表达量分别为0.54± 0.09、0.50±0.06，均低于对照组的1.00± 0.09、1.00± 0.06（P均＜0.05）；RES干预组PASMC中FOXO3a、p27蛋白表达量分别为0.91±0.08、0.82±0.06，均高于5-HT刺激组（P均＜0.05）；RES+SIRT1抑制剂干预组PASMC中FOXO3a、p27蛋白表达量分别为0.64±0.12、0.61±0.05，均低于RES干预组（P均＜0.05）；RES+FOXO3a抑制剂干预组p27蛋白表达量为0.64±0.08，低于RES干预组（P＜0.05）。

3 讨论

PH是一种常见的临床综合征，目前的治疗药物虽在一定程度上降低了患者的肺动脉阻力和压力，但这些药物常伴有较明显的不良反应，且治疗费用极为昂贵。RES是一种天然多酚化合物，主要来源于红葡萄、花生等，是植物在应激反应、损伤以及病毒感染后产生的一种植物抗毒素。其药理作用广泛，包括抗炎、抗氧化、抗细胞增殖、抗衰老等。近年来的研究表明，RES可以降低多种肿瘤的发病率以及逆转血管增殖性疾病的血管重塑［2-4］。本研究发现RES可以抑制PASMC增殖，提示RES可能成为治疗PH的潜在药物。

SIRT1在血管中表达丰富，在血管稳态及血管重塑中发挥重要调节作用［7］。大量证据表明，SIRT1在PH患者及动物模型的肺组织中低表达，并参与肺血管重塑的调控，在PH中起抑制作用。SIRT1还能通过调控多种下游分子的表达，从而抑制细胞周期进展以及PASMC的增殖［13］。FOXO3a蛋白是叉头蛋白转录因子家族中的一员，通过转录激活或抑制下游靶基因，在细胞增殖、凋亡、自噬和炎症等方面发挥重要作用，且其表达和转录活性受到SIRT1的调控［8-9］。研究发现，RES可通过SIRT1上调FOXO3a蛋白表达，从而抑制血管平滑肌增殖以及血管重塑的发生［14］。本研究也发现，RES可明显上调SIRT1蛋白表达，并抑制PASMC增殖；而预先抑制SIRT1可逆转RES对PASMC增殖的抑制作用。进一步研究发现，RES可上调FOXO3a蛋白表达，而预先抑制SIRT1可逆转RES对FOXO3a蛋白的上调。以上结果提示，RES通过激活SIRT1/FOXO3a信号通路抑制PASMC增殖。

p27蛋白是负性细胞周期调节蛋白家族的重要成员之一，通过抑制Cyclin D1-CDK4/CDK6复合物以及Cyclin E-CDK2复合物的激酶活性，从而阻碍细胞从G1期进入S期，负向调控细胞周期的进行。研究发现，在多种恶性肿瘤细胞中p27蛋白表达降低，且与肿瘤患者预后呈正相关。上调p27蛋白表达可抑制细胞周期的进展和细胞增殖。研究发现，p27蛋白是FOXO3a的下游重要靶点之一，FOXO3a蛋白可上调p27蛋白表达，使细胞周期阻滞，从而抑制哺乳动物细胞增殖［10-11］。本研究发现，RES可明显上调p27蛋白表达以及抑制PASMC增殖，抑制SIRT1或FOXO3a蛋白可阻断RES对p27蛋白表达的上调以及对PASMC增殖的抑制作用。以上结果提示，RES通过激活SIRT1/FOXO3a信号通路上调p27蛋白表达，从而促进PASMC增殖。

本研究发现，RES可明显抑制PASMC增殖，并上调FOXO3a及p27蛋白表达。进一步研究发现，预先采用SIRT1或FOXO3a特异性抑制剂或转染p27 siRNA可逆转RES对PASMC增殖的抑制作用。抑制SIRT1可阻断RES对FOXO3a和p27蛋白表达的上调，抑制FOXO3a蛋白亦可阻断RES对p27的上调。以上研究结果提示，RES可通过激活SIRT1蛋白，上调FOXO3a蛋白，进而上调细胞周期抑制蛋白p27，最终抑制PASMC增殖。本研究证实了RES对PASMC增殖的抑制作用以及潜在机制，为研发新的靶向治疗药物提供了思路。但目前RES在PH中的治疗作用仍处于临床前研究阶段，其治疗PH的有效性、安全性及最佳治疗剂量等问题仍需进一步的临床试验来验证。