高丽丽，脱 颖，周建文，张芬芬，梁英杰，朱长乐

免疫组化技术已成为临床病理诊断中常规检测手段之一，特别是在判断肿瘤组织的起源、分类以及良、恶性肿瘤的鉴别诊断等方面发挥重要作用。但在实际工作中，因工作环境、检测方法及个人操作差异等因素影响染色结果的准确性和稳定性。全自动免疫组化仪的应用对免疫组化标准化染色起到了推动作用，可以有效解决人为因素对染色结果的影响[1-4]。本实验对四种全自动免疫组化仪检测五种抗体染色的结果进行比较，优化染色流程，最终达到一致性高的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料回顾性选取中山大学附属第一医院病理科存档的浸润性乳腺癌标本5例和淋巴瘤标本5例。

1.2 仪器设备与试剂全自动免疫组化仪为美国Roche公司的Ultra、德国Leica公司的BOND-Ⅲ、丹麦DAKO公司的Link 48和Omnis。一抗分别为Ki-67(MIB-1)、CKpan(AE1/AE3)、CD5(4C7)、BCL-6(PG-Bbp)均购自丹麦DAKO公司，Calponin(EP63)购自北京中杉金桥公司。二抗及显色系统、苏木精复染液均为相应仪器自带套装。

1.3 方法常规脱水、包埋石蜡组织块，2～3 μm厚切片，并将切片捞于带阳性对照的防脱片上，于60～70 ℃烤箱烘烤1～2 h。按提前设置好的程序上机染色，浸润性乳腺癌标本染色Ki-67、Calponin、CKpan；淋巴瘤标本染色CD5、BCL-6，染色后的切片清洗后常规脱水、透明、封固。

2 结果

2.1 四款仪器染色比较Ki-67阳性定位于细胞核，为棕黄色着色。5例浸润性乳腺癌标本中，除1例出现四款仪器染色结果各不相同外，Link48染色阳性率和强度最低，Omnis和BOND Ⅲ染色强度较Link48强，但阳性率不高，Ultra染色阳性率和强度最高；其余染色结果一致(图1)。Calponin阳性定位于细胞质，为棕黄色着色。四款仪器免疫组化Roche Ultra染色强度较弱，其余染色结果一致。CKpan阳性定位于细胞质，为棕黄色着色。四款仪器免疫组化Leica BOND-Ⅲ染色强度过强，其余染色结果一致。CD5阳性定位于细胞膜，为棕黄色着色。四款仪器免疫组化Leica BOND-Ⅲ染色强度过强，其余染色结果一致。BCL-6阳性定位于细胞核，为棕黄色着色。四款仪器免疫组化DAKO Link 48和Omnis染色强度较弱，其余染色结果一致。

图1 四款仪器检测Ki-67染色：A. DAKO Link 48染色；B. DAKO Omnis染色；C. Leica BOND-Ⅲ染色；D. Roche Ultra染色

2.2 优化染色流程后四款仪器染色比较经过测试，确定最终相应抗体的染色流程调整。(1)Ki-67：DAKO Link48一抗孵育时间延长至30 min，DAB显色时间延长至10 min；DAKO Omnis二抗孵育时间延长至25 min；Leica BOND Ⅲ延长抗原修复时间至30 min。(2)Calponin：Roche Ultra抗原修复时间延长至90 min。(3)CKpan：Leica BOND-Ⅲ抗原修复时间减短为10 min。(4)CD5：Leica BOND-Ⅲ染色程序未改动，一抗1 ∶1稀释。(5)BCL-6：DAKO Link 48二抗染色后增加增强试剂孵育30 min，阻断剂调整至滴加一抗后孵育1 min；Omnis二抗染色后增加增强试剂孵育30 min。流程优化后，各个抗体在四种检测平台上染色结果一致。

3 讨论

Ki-67是重要的细胞增殖标志物,肿瘤细胞增殖情况可作为预测恶性肿瘤发展及临床预后的指标，研究表明Ki-67表达与乳腺癌临床病理特点及预后有一定的相关性；另外，近年来p16/Ki-67双重染色检测作为子宫颈癌筛查技术，改善了子宫颈癌筛查的灵敏度和特异性。

乳腺诊断病理中乳腺导管原位癌与早期微小浸润癌的诊断与鉴别诊断一直是难点。是否存在肌上皮标记是诊断有/无浸润的关键。Calponin蛋白是一种相同分子质量3.4×104多肽，在平滑肌组织中广泛表达，并参与收缩机制。Calponin与肌纤维母细胞的交叉反应较轻，特异性好，可作为临床肌上皮标志物。

细胞角蛋白是一种中间丝，在细胞内形成一个复杂的细胞骨架网络，并与相邻细胞的细胞骨架相互作用。CK(AE1/AE3)又称CKpan，属于广谱CK。CKpan已用于检测常规病理检查难以发现的微转移[5-6]。

CD5是T细胞和少数B细胞表面表达的一种相对分子质量为6.7×104的糖蛋白。研究证实，CD5可以通过提供一些细胞因子控制异常的免疫反应，但是CD5+淋巴细胞可能对人体有害。

BCL-6蛋白是生发中心B细胞的标志物之一，也表达于生发中心细胞及其起源的淋巴瘤中。可与CD10一起作为滤泡中心B细胞的标记。

免疫组化染色结果准确性极大影响临床病理诊断，特别在肿瘤鉴别诊断、早期微小浸润等方面。为减少手工操作对免疫组化准确性及稳定性的影响，大多数病理科已开展全自动免疫组化染色。但是仍然会出现相同的抗体在不同检测平台上染色结果不一致，因此对于每一种科室新增、更换克隆号或批号的抗体都要进行性能验证。若科室有不同厂家或型号免疫组化仪，性能验证既要纵向比较也要横向比对，对于染色偏弱或强的抗体，横向比对更容易发现问题。

免疫组化操作步骤复杂，影响其结果的因素很多，如抗体浓度、抗原修复时间、一抗/二抗/DAB孵育时间、H2O2抑制剂滴加顺序、增强剂的使用等因素。目前大多病理技术员已使用仪器进行免疫组化染色，仪器染色的流程、每一种试剂的用途，染色程序的设置，都应该熟悉掌握。当出现染色异常时，我们能及时调整染色流程，优化方案，最终呈现出准确稳定的染色结果。