杜春平，曾丽霞，陈志宁，陈肖瑜，林思彤，骆成飘，马 韵

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤，包含多种病理组织学类型，其中甲状癌乳头状癌是最常见的类型[1-2]。甲状腺癌分子机制的分析，能够推动其诊疗技术的发展[3-4]。酪氨酸硫酸化转移酶1(tyrosylprotein sulfotransferase 1, TPST1)主要负责催化细胞内酪氨酸硫酸化。研究发现TPST1在部分癌组织中表达下调，并与临床病理特征相关[5]。TPST1与甲状腺癌关系尚不明确。本实验通过多个甲状腺乳头状癌研究队列的大数据和免疫组化检测，分析TPST1在甲状腺乳头状癌中的表达、临床及其分子意义，为临床与病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源甲状腺乳头状癌队列分别来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA队列；基因芯片公共数据库(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE27155、GSE3467和GSE6004队列。THCA队列的RNA测序数据和临床数据包含572例样本(肿瘤组513例、对照组59例)。GSE27155、GSE3467和GSE6004队列的基因表达芯片数据分别包含55例(肿瘤组51例、对照组4例)、18例(肿瘤组9例、对照组9例)和18例(肿瘤组14例、对照组4例)样本。

1.2 数据分析UCSC Xena软件(https://xenabrowser.net)分析TPST1 mRNA在THCA队列中的表达。GEO2R软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析TPST1 mRNA在GSE27155、GSE3467和GSE6004队列中的表达。R软件(https://www.r-project.org)分析THCA队列的转录组数据，筛选与TPST1相关的差异表达基因。R软件对差异基因进行基因本体论(Gene ontology, GO)富集分析。

1.3 免疫组化收集2020年1～4月广西医科大学附属肿瘤医院16例甲状腺乳头状癌和癌旁正常组织。TPST1多克隆抗体购自Origene公司。免疫组化采用EnVision法染色，具体操作步骤及评分方法详见文献[6]。本实验经广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。

1.4 统计学分析采用R软件进行统计学分析。秩和检验分析TPST1 mRNA的差异表达，并用中位数表示。TPST1蛋白的差异表达采用t检验，并用平均数表示。以TPST1 mRNA中位数为参照，低于中位数为低表达组，高于中位数为高表达组。两者的相关性采用χ2和r检验。Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较TPST1低、高表达组间的预后。Pearson相关检验筛选TPST1的差异表达基因，筛选标准为：P<0.05，r>0.4或<-0.4。

2 结果

2.1 各甲状腺组织中TPST1 mRNA的表达应用4个甲状腺乳头状癌队列分析587例甲状腺乳头状癌组织和76例对照组织，分析TPST1 mRNA的差异表达。与对照组相比(THCA队列：8.610；GSE27155队列：2.968；GSE3467队列：8.142；GSE6004队列：9.869)，TPST1 mRNA在THCA队列(7.883，P<0.001)、GSE27155队列(2.717，P=0.005)、GSE3467队列(7.393，P=0.008)和GSE6004队列(9.217，P=0.012)的癌组织中均表达显著下调(图1)。

图1 TPST1 mRNA的表达：THCA(A)、GSE27155(B)、GSE3467(C)和GSE6004(D)队列中，比较TPST1 mRNA在正常甲状腺组织和甲状腺乳头状癌组织的表达

2.2 甲状腺癌中TPST1 mRNA表达与临床病理特征及预后的关系本实验分析THCA队列中有504例甲状腺癌中TPST1 mRNA与临床病理特征及预后的关系，结果显示：TPST1 mRNA与病理分期(P=0.029，r=-0.10)、T分期(P<0.001，r=-0.215)、N分期(P<0.001，r=-0.213，表1)等呈负相关。TPST1 mRNA高表达组的无瘤生存期(P=0.003)和无进展生存期(P=0.009)显著高于低表达组；但总生存率(P=0.261)和疾病特异生存率(P=0.156)差异无统计学意义(图2)。

图2 TPST1 mRNA与甲状腺乳头状癌患者的预后分析：A无瘤生存期；B.无进展生存期

表1 甲状腺乳头状癌中TPST1 mRNA与临床病理特征的相关性

2.3 甲状腺癌中TPST1蛋白的表达免疫组化检测TPST1蛋白在16例甲状腺乳头状癌组织和16例对照组织中的表达，结果显示：TPST1主要定位于细胞质，TPST1在甲状腺乳头状癌组(2.000±0.2415)中的表达显著低于对照组(2.813±0.2918，P=0.040，图3、4)。

图3 TPST1蛋白在组织中的表达，EnVision法：A.正常甲状腺组织；B.甲状腺乳头状癌组织

2.4 TPST1共表达基因及其功能生物信息学分析筛选TPST1共表达基因976个，其中呈正相关有MAGEH1、FHL1和TIMP3等686个基因(P<0.05，r>0.40)，呈负相关有CDK16、FN1和MET等290个(P<0.05，r<-0.4)基因。GO分析发现，这些基因的分子功能主要是蛋白酶结合、钙黏蛋白结合参与细胞与细胞的黏附、细胞黏附分子结合、磷酸酶结合等。参与的生物学过程主要是MAP激酶活性的调控、血管内皮生长因子信号通路、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调控、调节GTPase的活性等。

3 讨论

本实验应用4个独立的甲状腺乳头状癌队列合计663例样本，比较TPST1在正常组织和肿瘤组织中的表达水平。大样本和多队列充分论证TPST1 mRNA在甲状腺乳头状癌中表达显著下调。免疫组化也证实TPST1蛋白在甲状腺乳头状癌中表达下调。TPST1可能是甲状腺乳头状癌的潜在标志物。另外，TPST1与病理分期、T分期和N分期等呈负相关，提示其表达下调，可能与甲状腺乳头状癌的发展有关。最后TPST1高表达组患者的无瘤生存期和无进展生存期显著高于低表达组，提示TPST1表达水平与患者预后有关，与Jiang等[5]在肺癌中的分析一致。本实验提示TPST1基因表达下调，可能与甲状腺乳头状癌的发生、发展和预后有关。

图4 TPST1蛋白在不同组织中表达的统计学分析

本组为揭示TPST1在甲状腺乳头状癌的中潜在分子机制，生物信息学筛选976个与TPST1相关的差异表达基因，这些基因中MAGEH1与细胞凋亡、周期阻滞和生长抑制有关，其表达下调可促进肝癌的进展[7]。FHL1是肿瘤抑制基因，可抑制肿瘤的生长和转移[8]。TIMP3是基质金属蛋白酶的抑制剂，可抑制肿瘤的侵袭和转移[9]。CDK16在多种肿瘤中高表达，可调节肿瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭、凋亡[10]。FN1能促进甲状腺癌细胞的迁移和侵袭[11]。MET在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的发生、发展及预后有关[12]。GO富集分析发现，TPST1与血管内皮生长因子信号通路、细胞的黏附等生物学功能有关。因此，TPST1可能与上述基因和生物功能共同影响甲状腺乳头状癌的恶性生物行为，还有待于进一步分析。

总之，本实验结果显示TPST1对甲状腺乳头状癌的发生、发展可能具有一定的影响，有望成为甲状腺乳头状癌诊断和预后的标志物。