王 曼，韩 莎，李 胜，张国安，王业全，崔 文

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，占甲状腺癌的80%～85%[1]。BRAF及TERT突变是PTC发生、发展的重要机制之一[2]，但PTC的发病机制并不十分明确。最新研究结果表明，自噬对肿瘤的发生、发展有着直接的关系[3]。在自噬小体的形成过程中，ATG5作为泛素样连接系统ATG12-ATG5-ATG16的关键因子，通过对自噬活性的调节，在恶性肿瘤的发生、进展中具有促进或抑制作用[4-5]。目前，关于ATG5在PTC中的表达情况尚不明确。本实验检测ATG5在正常甲状腺组织、PTC原发灶、癌旁组织及淋巴结转移灶中的表达，分析其与PTC临床病理特征的关系，探讨ATG5表达的改变在PTC发生、发展中的意义，为PTC的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2017年山东省济宁市第一人民医院病理科确诊的100例PTC，均具有完整的临床及随访资料，包括患者年龄、性别、术前体重、身高、身体质量指数(body mass index, BMI)、月经状况、肿瘤大小、包膜浸润与否、多灶性、甲状腺侵袭性、淋巴结转移程度、是否伴有桥本甲状腺炎和结节性甲状腺肿。100例患者中男性27例，女性73例；年龄最小者17岁，最大者75岁，平均46.33岁。本组分别选取100例PTC原发灶、癌旁组织及其50例PTC淋巴结转移灶进行分析，另选取23例正常甲状腺组织作为对照。所有患者均签署知情同意书。

1.2 免疫组化兔抗人ATG5(ab108327，1 ∶100)多克隆抗体购自中国Abcam公司，DAB染色液套盒购自罗氏公司。标本均经10%中性福尔马林固定后取材，经LEICA APS300S全自动脱水机对标本进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，利用罗氏公司的全自动免疫组化染色仪Benchmark XT及其配套二抗试剂盒、DAB染色液套盒，采用液盖膜涡流混匀法进行免疫组化染色，镜下观察。

1.3 结果判定结果判读参考文献[6]。由两名具有中级以上职称的病理医师分别采用双盲法进行阅片，综合评出最后结果。其中，每张切片随机取5个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比评分和着色强度评分。按阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分。ATG5表达定位于细胞膜，阳性结果呈棕黄色或棕褐色，按细胞着色强度评分：无明显着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相乘：(评分范围0～9分)。总分<6分为低表达(阴性)，总分≥6分则为高表达(阳性)。

2 结果

2.1 PTC原发灶、癌旁组织、正常甲状腺组织及淋巴结转移灶中ATG5的表达免疫组化结果显示，ATG5大部分定位于细胞膜，小部分定位于细胞质。PTC原发灶、癌旁组织、正常甲状腺组织及淋巴结转移灶中ATG5的表达各不相同，着色强度有差异(图1)。统计结果显示，ATG5在正常甲状腺组织的阳性率为17.4%(4/23)，在癌旁组织中的阳性率为31.0%(31/100)，在PTC组织中的阳性率为82.0%(82/100)，在淋巴结转移灶中的阳性率为96.0%(48/50)。正常甲状腺组织和癌旁组织相比，差异无统计学意义(P>0.05)；正常甲状腺组织与PTC组织(P<0.01)，癌旁组织与PTC组织(P<0.01)，PTC组织与淋巴结转移灶组织(P<0.05)相比，差异均有统计学意义(图2)。

图1 ATG5在甲状腺组织中的表达：A.正常甲状腺组织；B.PTC癌旁组织；C.PTC原发灶；D.淋巴结转移灶；下图为上图的局部放大

图2 不同甲状腺组中ATG5的表达

2.2 PTC组织中ATG5的表达与临床病理特征的关系PTC组织中ATG5蛋白表达与患者性别、体重、BMI、多灶性、双叶多发、浸润包膜、伴有结节性甲状腺肿、桥本甲状腺炎和淋巴结转移均无关(P>0.05)，与患者年龄、肿瘤最大径、淋巴结侵犯数目有关(P<0.05)，年龄≤40岁、肿瘤直径>1 cm、淋巴结侵犯个数>3个的PTC患者ATG5的表达水平较高(表1)。

表1 PTC组织中ATG5蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨论

自噬性程序性细胞死亡，简称自噬，是一种新的程序性细胞死亡方式，在生物体的生长发育、细胞分化以及肿瘤等疾病的发生、发展中发挥着重要的作用，又称为Ⅱ型程序性细胞死亡。在癌症发生早期，自噬可以通过溶酶体的消化降解作用，去除细胞内异常的蛋白质和受损的细胞器，对肿瘤的发生、发展起抑制作用。在癌症进展期，自噬可以降解细胞内大分子物质，为肿瘤细胞提供生存所需能量，特别是在低氧、营养物质缺乏时，自噬则对肿瘤细胞的恶性增殖起促进作用。自噬小体的形成是自噬过程的关键，而自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)则在自噬小体的形成中起主要的调控作用，并参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统即ATG12-ATG5-ATG16和ATG8-LC3共轭系统。其中，ATG12-ATG5-ATG16复合物在自噬小体生成时参与膜小叶的形成和膜的延伸。有研究表明，在ATG12-ATG5-ATG16复合物中，ATG5起关键作用，并直接与许多蛋白质相互作用，在自噬体成熟中至关重要，是自噬的关键调节因子。

ATG5在肿瘤组织中的表达与肿瘤类型有关。李佽等[5-8]研究均发现ATG5在前列腺癌中表达显著高于良性前列腺增生或正常细胞。在肝癌[9]及非小细胞肺癌[10]中ATG5表达均高于癌旁组织。Cao等[11]的研究显示ATG5在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织，但An等[12]研究却显示其表达低于正常组织。在结肠癌中，ATG5的表达也降低[13]。在肾透明细胞癌中，ATG5表达高于癌旁组织，其高表达与肿瘤恶性程度[14]、患者低生存率相关。在乳腺癌中，约40%病例ATG5阳性，且ATG5阳性患者无瘤生存期更长。在口腔鳞状细胞癌中，ATG5高表达的患者其生存率高于低表达患者，但差异无统计学意义(P=0.064)。在上皮性卵巢癌组织中ATG5的表达明显低于良性卵巢组织及正常卵巢组织。ATG5在不同恶性肿瘤中表达趋势及临床病理意义并不相同，可能由于自噬是一个涉及多种ATG的复杂过程，并且自噬在肿瘤的不同阶段可能起不同的作用。

本实验采用免疫组化法检测PTC、癌旁组织、正常甲状腺组织及淋巴结转移灶中ATG5蛋白的表达，证实PTC组织中ATG5的表达显著高于癌旁组织及正常甲状腺组织，明显低于淋巴结转移灶。其次通过ATG5的表达与临床病理特征分析可知，PTC组织中ATG5蛋白表达与患者年龄、肿瘤最大径、淋巴结侵犯数目有关(P<0.05)，且年龄≤40岁、肿瘤直径>1 cm、淋巴结侵犯个数>3个的PTC患者ATG5的表达水平高，提示ATG5可能参与PTC的生长及转移。

综上所述，ATG5在PTC中的表达高于正常甲状腺组织，低于淋巴结转移组织，提示其可能参与了PTC的生长及转移过程。其具体机制有待进一步研究证实。