纪晓坤，杜 芸，王 蕊，吴 娟，马 阳，郭 晓，刘 颖，张 艳

每年全球约138万人死于肺癌[1]，在中国肺癌的发病率和病死率居恶性肿瘤的首位，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的85%。EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，在靶向治疗中得到广泛研究和应用，EGFR检测对于NSCLC靶向治疗的选择至关重要。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗NSCLC初期疗效显著，副作用较小。然而，大多数EGFR突变患者在EGFR-TKI治疗期间出现耐药基因T790M突变，而使EGFR-TKI疗效下降、疾病进展。因此，重新检测EGFR突变状态，选择恰当的EGFR-TKI成为靶向治疗必不可少的选择。

EGFR检测的标本均为福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE)的组织学标本，细胞学标本应用较少。但是大多数肺癌患者发现时已为晚期，无法通过手术、活检等获得FFPE标本进行病理诊断及EGFR[2-4]检测。但所有患者均可获得细胞学标本，且创伤性小，约17.7%的患者仅通过支气管镜刷片即可明确诊断[5]。本文着重探讨HE染色细胞学涂片与配对FFPE标本之间EGFR突变状态的符合率，并分析FFPE标本失败的原因，为临床和病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2012年12月～2018年9月细胞学确诊NSCLC患者275例，细胞学标本包括支气管镜刷片及灌洗液、活检或手术切除组织印片、细针穿刺涂片；所有细胞学标本均有配对FFPE标本。支气管镜刷片及灌洗液、活检或手术切除印片的细胞学涂片，与其配对的FFPE标本EGFR检测同行进行，而远处转移部位的细针穿刺细胞学(fine needle aspiration, FNA)涂片及其配对的手术切除FFPE标本EGFR检测未同时进行。

细胞学涂片经95%乙醇固定10 min，行HE和免疫细胞化学染色(SP法)[6]，由经验丰富的病理医师诊断并判断肿瘤细胞含量。FFPE标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，由经验丰富的病理医师诊断并判断肿瘤细胞含量。

Hagiwara等[7]报道FFPE标本进行基因检测的癌细胞含量≥1%，若癌细胞含量<1%，则不能明确诊断，第二使用这种样本进行基因检测会出现假阴性的结果。本实验室用于EGFR检测的HE染色细胞学涂片的癌细胞含量≥100个，FFPE标本癌细胞含量≥1%。

1.2 DNA提取、纯化和保存每个标本编取一个唯一标识码，所有实验均在生物安全柜内进行，由经过考试合格的卫生技术人员佩戴一次性手套、口罩操作，实验中所用的移液器枪头为一次性带滤芯枪头。若实验过程中手套触碰了样品，需及时更换手套，避免造成交叉污染。实验过程为防止气溶胶污染，逐一加样迅速盖紧盖子。细胞学涂片用记号笔在载玻片反面标记肿瘤细胞富集区，用一次性盖玻片(以防止交叉污染)刮取富集区的肿瘤细胞(图1)于相应标识码的EP管中，使用组织DNA提取试剂盒(Cat No. ADx-T101-R)购自厦门艾德生物公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。FFPE标本使用FFPE DNA提取试剂盒(Cat No. ADx-FF01)购自厦门艾德生物公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

图1 刮取HE染色细胞学涂片上的肿瘤细胞：A.记号笔标记肿瘤细胞富集区；B.用一次性盖玻片刮取标记区域的肿瘤细胞；C.刮取后的细胞学涂片

超微量紫外分光光度计检测DNA纯度即OD260/OD280比值(1.8～2.0)。细胞学涂片的DNA上样浓度为0.4～1 ng/μL，FFPE为1.5～3 ng/μL，剩余DNA于-80 ℃保存。

1.3 EGFR突变检测EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)及ABI 7500PCR仪(美国Thermofisher)检测18～21外显子的29种突变。8连管每孔包含细胞学标本DNA 2 ng或FFPE DNA 7.5 ng，按试剂盒说明书分析检测结果。

2 结果

2.1 临床病理特征本组275例患者中女性122例，男性153例；其中226例患者行手术治疗，术后随访出现远处淋巴结转移经FNA涂片HE染色和免疫细胞化学染色确诊NSCLC转移(图2)，HE染色FNA涂片进行EGFR检测，回顾性分析其手术切除标本EGFR检测结果；余49例HE染色细胞学涂片及其配对FFPE标本EGFR检测同时进行。病理特征：247例肺腺癌，2例肺泡细胞癌，1例黏液腺癌，8例腺鳞癌，15例鳞状细胞癌，2例黏液表皮样癌。

图2 A：肺腺癌HE染色；B：TTF-1呈阳性，SP法；C：Napsin A呈阳性，SP法；D：p40呈阴性，SP法

2.2 EGFR检测275例HE染色细胞学涂片均成功提取高质量、高纯度DNA，并完成EGFR检测(表1)，113例检测到突变，阳性率41.1%(图3)，其中G719X突变4例，19del 41例，L858R突变58例，20ins 3例，获得性耐药T790M和19del双突变6例，L858R和S768I双突变1例。113例FFPE标本检测有EGFR突变，其中G719X、L858R、20ins、L858R和S768I双突变结果与细胞学涂片结果一致，19del 47例，未检测到T790M和19del双突变(表2)。2例EGFR野生型FFPE标本检测失败。

图3 HE染色细胞学涂片检测EGFR突变

表1 275例HE染色细胞学涂片EGFR突变检测

表2 HE染色细胞学涂片与配对FFPE标本EGFR突变的对比分析

3 讨论

目前，细胞学涂片检测EGFR的报道较少[8-10]。巴氏、瑞氏染色的细胞涂片是进行基因检测的最佳选择，尤其是在细胞块细胞含量不足时[8,11]。Mitiushkina等[12]利用归档的HE染色涂片提取DNA进行基因检测结果不稳定，有2例失败。本组成功检测275例HE染色细胞学涂片的EGFR突变状态，并对比分析其配对FFPE标本的检测结果。本组有107对EGFR突变和160对野生型NSCLC患者结果完全吻合；6例患者手术切除FFPE标本为19del，而远处淋巴结转移标本经HE染色FNA涂片为19del和T790M双突变；2例远处淋巴结转移标本经HE染色FNA涂片结果为野生型，而其配对的手术切除FFPE标本检测失败。查阅病史资料有6例19del和T790M双突变的HE染色FNA涂片患者，在手术切除后接受EGFR-TKI治疗。结果显示：与FFPE标本相比，HE染色细胞学涂片是DNA提取和EGFR检测更可靠的选择，并能更好的指导临床用药。

由于FFPE标本提取的DNA片段化，用PCR法检测EGFR的失败率较高[13]。本实验进一步证实，DNA暴露于福尔马林和石蜡等使其产生交联和片段化，不适用于PCR检测。2例失败FFPE标本保存5年，提取的DNA片段化严重，无法用PCR法检测基因状态。因此细胞学标本成为EGFR检测更好的选择，并能指导TKI治疗。

细胞学标本适用于肿瘤晚期不能行手术的患者，且创伤小；提取的DNA质量高、完整性好。HE染色细胞学涂片进行EGFR检测，可使细胞病理学医师在提取DNA前观察肿瘤细胞含量，避免因细胞块和活检FFPE标本肿瘤细胞含量不足而出现假阴性。HE染色细胞学涂片进行EGFR检测与FFPE标本相比具有以下优点：(1)明确诊断并直接评估肿瘤细胞含量；(2)无需额外取材，且省时省力；(3)避免DNA暴露于福尔马林和石蜡中产生交联和片段化；(4)及时进行EGFR检测，避免延误患者的靶向治疗。Betz等[8]认为，细胞病理学专家应在有限的细胞学上最大限度地发挥细胞学标本的用途。

研究表明，细胞学标本和FFPE标本在EGFR检测中具有良好的一致性。此外，对于多年保存的FFPE样本在提取的DNA严重片段化时，用细胞学标本进行EGFR突变检测是一个更好的选择。