景桂英，郑炫针，季晓霞，钱 余

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球常见的恶性肿瘤之一。据估计2018年全球有超过180万CRC新发病例和88.1万CRC患者死亡，约占全部恶性肿瘤的1/10[1]。近年CRC诊断及治疗水平不断进步，但难治性、转移性CRC发生率仍较高，且CRC患者总生存率并未得到有效改善[2]。目前，某些生物学标志物已被证实与CRC的发生、发展及预后显著相关，例如癌胚抗原CA19-9和CA72-5可用于检测CRC患者复发[3]；p53或KRAS基因的微卫星不稳定性和突变已被用作CRC预后的预测因素[4]。然而上述生物学标志物的可靠性仍存在争议，因此开发新的CRC诊断和预后生物学标志物以及治疗靶标是临床迫切的需求。RNA结合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)属于富含甘氨酸的蛋白，在结构上具有能够与RNA和DNA结合的RNA识别基序。RBM3是重要的冷应激蛋白，环境刺激如体温过低、局部缺血和缺氧可以增加其表达[5]。在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和膀胱癌等癌细胞中，RBM3表达的上调可促进细胞分化并防止细胞凋亡[5-6]，但其在CRC中的研究并不多见。本实验采用免疫组化SP法检测CRC组织中RBM3表达，探讨其与临床病理特征及预后的关系，以期为CRC诊断和预后生物学标志物提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2014年1月1日～2018年12月31日上海市杨浦区控江医院病理科存档的CRC根治术切除的石蜡标本150例。所有病例均经术后病理学诊断为原发性腺癌，且术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。150例CRC中男性89例，女性61例，平均年龄(64.29±13.80)岁。肿瘤直径≥5 cm者62例，<5 cm者88例。肿瘤部位：结肠120例，直肠30例。肿瘤浸润深度：T1期9例，T2期27例，T3期94例，T4期20例；有淋巴结转移者55例，无淋巴结转移者95例；有远处转移者43例，无远处转移者107例。根据2016年美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)制定的TNM分期进行分类：Ⅰ期30例，Ⅱ期35例，Ⅲ期67例，Ⅳ期18例。另收集在我院体检行肠镜活检的正常结直肠黏膜组织石蜡标本46例，其中男性21例，女性25例，平均年龄(68.39±14.63)岁。本实验经我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法免疫组化染色采用SP法，取CRC组织和正常结直肠黏膜组织石蜡标本，4 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化。柠檬酸缓冲液高温修复抗原，3%H2O2孵育10 min，加入10%山羊血清封闭10 min。加入1 ∶500稀释的兔抗人RBM3单克隆抗体(购自Abcam公司)4 ℃过夜孵育，次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体(购自北京中杉金桥公司)。PBS冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明，封固，镜下观察。

1.3 结果判断由两位高年资病理科医师独立阅片，每张切片随机选取5个高倍镜视野(400×)计数细胞。RBM3蛋白表达以细胞核呈棕黄或棕褐色颗粒为阳性。按细胞染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色或深黄色为2分，棕黄或棕褐色为3分。按阳性细胞数所占比例评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。两者相乘即为总评分，两位病理医师所得的总评分取平均分即为最终评分，其中0～6分为RBM3蛋白低表达，6～12分为RBM3蛋白高表达[7-8]。

1.4 随访通过门诊复查或电话访问对所有CRC患者进行随访，以患者行CRC根治术时间作为起始时间，以CRC患者死亡为终点事件，随访截止时间为2020年3月31日。

1.5 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料如RBM3蛋白低表达与高表达者的临床病理特征比较采用χ2检验，RBM3蛋白不同表达水平CRC患者生存率的比较采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC和正常结直肠黏膜组织中RBM3蛋白表达150例CRC组织中RBM3蛋白高表达率为34.0%(51/150)，46例正常结直肠黏膜组织中RBM3蛋白高表达率为69.6%(32/46)，两者比较差异有统计学意义(χ2=18.239，P<0.001，图1)。

图1 A.正常结直肠黏膜组织中RBM3高表达，SP法；B.CRC组织中RBM3低表达，SP法；C.CRC组织中RBM3中度表达，SP法；D.CRC组织中RBM3高表达，SP法

2.2 CRC中RBM3蛋白表达与临床病理特征的关系RBM3蛋白高表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、发病部位无关(P均>0.05)，而与肿瘤浸润深度(χ2=5.404，P=0.020)、淋巴结转移(χ2=4.157，P=0.041)、远处转移(χ2=4.589，P=0.032)和TNM分期(χ2=5.760，P=0.016)均呈负相关(表1)。

表1 CRC中RBM3蛋白表达与临床病理特征的关系

2.3 RBM3蛋白表达与预后的关系Kaplan-Meier生存分析发现，RBM3蛋白高表达的CRC患者生存时间为(53.24±2.47)个月，而低表达者生存时间为(44.39±2.59)个月。经Log-rank检验可知RBM3蛋白高表达的CRC患者生存率显著高于低表达者(χ2=4.128，P=0.042，图2)。

图2 CRC中RBM3蛋白表达与患者生存期的关系

3 讨论

CRC作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发生、发展以及转移是一个涉及多因素和多阶段的复杂过程，其中一个主要因素是抑癌基因与原癌基因的缺失、错位、突变的积累效应。RBM3基因位于人染色体Xp11.23，编码含157个氨基酸的蛋白质，RBM3蛋白是重要的冷应激蛋白，其表达量在受到冷刺激时上调。RBM3的主要生物学功能是介导冷诱导下细胞抗凋亡的保护作用，参与缺氧应激、细胞增殖等生理过程，还可以作为原癌基因在生物学过程中充当调控因子。RBM3通常被认为是潜在的原癌基因，主要有以下原因：(1)RBM3表达水平与肿瘤分期密切相关，表明其可能与肿瘤的发生有关；(2)RBM3基因沉默可以增加G2/M期的细胞数量，并最终导致细胞凋亡；(3)RBM3可改善COX-2、IL-8和VEGF mRNA的稳定性和翻译效率[9]。此外，RBM3可直接与mRNA结合，改变mRNA的二级结构，并影响mRNA起始因子进入核糖体亚基的作用，从而调节肿瘤中激酶的潜在活性。

本实验通过免疫组化SP法发现CRC组织中RBM3蛋白高表达率显著低于正常结直肠黏膜组织，且通过分析RBM3表达与CRC临床病理特征的关系发现RBM3高表达与肿瘤浸润深度(T3+T4)、淋巴结转移(N1+N2)、远处转移(M1)和TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)呈负相关，提示RBM3在CRC发生、发展中可能是候选抑癌基因。Wnt/β-catenin信号通路失调是控制CRC侵袭性和肿瘤干细胞活性的关键因素。约80%的散发性和遗传性的CRC是由于APC基因和β-catenin基因突变引起Wnt/β-catenin通路过度激活造成的。RBM3过表达导致GSK3β磷酸化，从而减弱β-catenin信号传导，并最终抑制CRC的发生、发展[10]。前期研究表明不同类型的癌症之间RBM3表达的生物学和临床意义有所不同。如与正常组织相比，RBM3在胃癌、前列腺癌和乳腺癌组织中的表达增加，但相对于非癌组织，RBM3在恶性黑色素瘤、CRC和膀胱癌组织中的表达降低。另外，Chen等[11]报道RBM3以正向方式调节ARPC2，并且通过转录后3′UTR结合监测调节作用，这种结合可介导RBM3在乳腺癌细胞转移和增殖中的关键作用。Dong等[12]发现环状RNA SCD-circRNA 2可能在RBM3的下游靶分子中起作用，从而影响肝细胞癌的进展。本组推测这些不同分析结果，可能是由于在单个器官中RBM3与其他被激活和表达的基因之间相互作用造成的。

本实验采用Kaplan-Meier生存分析发现RBM3蛋白高表达的CRC患者生存率显著高于低表达者，提示RBM3高表达与CRC患者术后良好预后相关。近期研究发现RBM3过表达与乳腺癌、CRC、黑色素瘤、胃癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和睾丸癌的预后改善有关；相反，其过表达与膀胱癌和前列腺癌的总生存期较差相关；Melling等[13]评估Ⅰ～Ⅲ期原发性CRC中RBM3的表达，发现RBM3高表达与总生存期长有关，且在原发性CRC中发现RBM3核表达是最强的预后因素。Jonsson等[14]发现RBM3在黑色素瘤发展过程中表达丢失，并且是预测患者总生存期延长的独立生物学标志物。在一项纳入11 152例前列腺癌患者的研究中，RBM3高表达被证实与肿瘤晚期、Gleason评分高、淋巴结受累和手术切缘阳性呈正相关；在包括RBM3高表达、Gleason评分、肿瘤分期、前列腺特异性抗原、手术切缘和淋巴结状态在内的多因素分析中，RBM3高表达对术后预后的影响仍具有统计学意义(P=0.008 4)，可见RBM3高表达是前列腺癌术后不良预后的独立危险因素[15]。

总之，RBM3蛋白高表达与CRC发生、发展及转移过程中的不良事件如肿瘤浸润、淋巴结转移等呈负相关，且与CRC预后良好有关。分析RBM3在CRC中的临床病理学意义和预后价值，有助于理解CRC发生、发展过程，有望为CRC诊断、靶向治疗和预后评估提供新靶点。