冯 琨，杨 堃，宋海云，王鸿宇，姜慧峰，李秋尧

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一，在东亚及非洲国家发病率较高，西方国家也呈逐年攀升趋势。HCC患者确诊时多为中晚期，预后较差，多数文献报道患者出现临床症状时其5年生存率低于5%[1]。碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)属于锌离子金属蛋白酶，广泛存在于哺乳动物体内，催化CO2水解为重碳酸盐和质子，CAⅨ是其重要一员[2]。CAⅨ的表达主要是在缺氧环境下，其位于Von Hippel-Lindau综合征(简称VHL综合征)肿瘤抑制基因的下游，由HIF-1α调节[3]。其在正常人体组织中主要表达于胃肠等消化道中，在多种人类恶性肿瘤如肾细胞癌、肺癌、结直肠癌、胆囊癌、胃食管癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、头颈部肿瘤及软组织肉瘤等均证实其存在过表达，并与肿瘤的恶性进展密切相关。本实验通过检测HCC及癌旁组织中CAⅨ的表达，分析其与HCC病理分化程度及预后的关系，并进一步通过细胞实验探讨CAⅨ与肝癌细胞增殖和侵袭的关系，为HCC的诊断、治疗及预后评估寻找新的分子标志物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2014年1月～2019年12月山东大学齐鲁医院(青岛)病理科存档的HCC 67例及癌旁对应肝组织石蜡标本。男性47例，女性20例，年龄38～79岁，平均58岁，术前均未接受其他治疗。依据HCC的Edmondson分级，将其分为3组：高分化组/Ⅰ级(20例)、中分化组/Ⅱ级(27例)、低分化组/Ⅲ+Ⅳ级(20例)。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，分别行HE及免疫组化LDP法染色。一抗兔抗单克隆抗体CAⅨ购自北京中杉金桥公司；二抗山羊抗兔/鼠购自美国罗氏公司。石蜡切片常规脱蜡，枸橼酸高压修复2 min，室温冷却后PBS液洗3次×3 min，3%H2O2去离子水常温10 min灭活内源性过氧化氢酶活性，PBS冲洗3次×3 min，滴加一抗，37 ℃恒温箱中孵育60 min，PBS冲洗3次×3 min，滴加二抗，37 ℃恒温箱中孵育15 min，PBS冲洗3次×3 min，DAB显色5 min，苏木精复染3 min，流水冲洗5 min，1%盐酸乙醇分色10 s，自来水(碱性)流水冲洗5 min，梯度乙醇脱水，透明，封固。PBS代替一抗作为空白对照。高倍镜下每张切片选择10个有代表性的视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，合计1 000个细胞。CAⅨ蛋白阳性定位于细胞膜，呈黄色，无背景着色。(1)按阳性细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；(2)按阳性细胞百分率计分：阳性细胞数≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～49%为2分，≥50%为3分。将两项得分结果相乘：0～3分为阴性(-)，4～9分为阳性(+)。

1.2.2细胞转染 人肝癌细胞株HepG2购于美国细胞库(ATCC)。脂质体Lipofectamine 2000、TR-脂质体Lipofectamine 2000、TR-Izol(Invitrogen，USA)；PrimeScripts RT Reagent Kit(Takara Bio Inc，Japan)；CCK-8(Dojindo，Kumamoto, Japan)；Transwell Flters (Millipore，USA)；RPMI 1640、Opti-MEMI培养液和胎牛血清(Gibco，USA)。CAⅨ过表达载体、干扰表达的siRNA以及CAⅨ引物由广州锐博公司设计与合成。Lipofectamine 2000转染试剂盒转染。实验分为阴性对照组(只有脂质体)、CAⅨ过表达组(CAⅨ过表达载体和脂质体)和CAⅨ干扰表达组(加入CAⅨ siRNA浓度为100 nmol/L和脂质体)。转染成功后于37 ℃ 5%CO2、饱和湿度条件下培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中48 h，收集细胞进行各项检测。

1.2.3qRT-PCR检测 提取各组细胞中的总RNA；采用PrimeScripts RT Reagent Kit试剂盒反转录合成cDNA；采用qRT-PCR技术检测CAⅨ在肝癌细胞株HepG2中的表达水平。每一样品重复3次，以U6作为内参，记录Ct值。定量PCR反应程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min预变性(1个循环)；95 ℃ 15 s，65 ℃1 min，合计40个循环。各组间CAⅨ相对定量的倍数用2-△△Ct值表示。

1.2.4CCK-8法检测 将CAⅨ过表达载体及siRNA转染入HepG2细胞。脂质体为阴性对照组，细胞接种于96孔板(2 000个/孔)，在37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。采用CCK-8试剂检测0、24、48、72、96 h细胞增殖数目的变化。

1.2.5细胞划痕法检测肝癌细胞株迁徙能力 将转染后的HepG2细胞分别培养于6孔板中，直到板孔被细胞覆盖，用200 μL移液器枪头刮1个直径约200 μm的垂直划痕，PBS冲洗3次，37 ℃孵育。24 h后在倒置显微镜下观察细胞平均迁徙面积，每组实验重复3次。

1.2.6Transwell法检测肝癌细胞株侵袭能力 按照Milipore公司Transwell小室说明书操作，于100 μL基质胶中以1 ∶8稀释的无血清培养基中过夜孵育。常规培养12～16 h，10%中性福尔马林固定细胞2 h，1%结晶紫染色，随机选5个视野计数，倒置显微镜观察并拍照。

1.3 随访HCC患者随访以确诊之日始，以2020年7月截止，以肿瘤复发、远处转移或死亡为终止事件。采用电话、门诊、住院等方式进行随访。随访过程中记录复发转移的部位、时间和死亡患者的时间及具体原因。观察患者的手术情况，并于术后每3个月复查上腹部MRI/CT、彩超、血液检验(主要为甲胎蛋白、肝功能及乙肝病毒复制)等评估疗效；计算患者总生存率并进行生存分析。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，CAⅨ蛋白表达与临床病理分型的相关性分析采用四格表χ2检验或行×列表χ2检验；3组定量数据对比先采用单因素方差分析，再行SNK-q或LSD-t检验，重复测量数据采用方差分析；采用Kaplan-Meier法生存曲线分析，并利用Log-rank检验分析差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 数据库分析使用UALCAN网站(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)检索TCGA数据库中关键词HCC与CAⅨ并进行分析，对本实验数据进行补充验证。

2 结果

2.1 HCC组织中CAⅨ的表达HCC组织中CAⅨ主要表达于癌细胞的胞膜，内对照为周围正常小胆管。67例HCC中24例阳性，43例阴性，阳性率为35.8%(24/67)；67例癌旁正常肝组织中CAⅨ均阴性。HCC中CAⅨ表达高于癌旁正常组织(χ2=29.236，P<0.05，表1，图1)。HCC按分化程度分为高、中、低分化组，免疫组化检测结果显示，CAⅨ蛋白的阳性率在高分化组中为10.0%(2/20)，在中分化组中为29.6%(8/27)，在低分化组中为70.0%(14/20)，阳性率随着肿瘤分化的降低而升高，各组之间有明显差异(χ2=16.413，P<0.05，表2)。上述结果表明CAⅨ表达上调与HCC的发生及分化程度相关。

表1 HCC与癌旁组织中CAⅨ的表达

表2 HCC不同分化程度分组中CAⅨ的表达

图1 A.CAⅨ在HCC组中呈阳性，LDP法；B.CAⅨ在癌旁组织中呈阴性，阳性为内对照，LDP法

2.2 预后生存分析截至2020年7月，67例患者均从住院或门诊复查获得信息资料。随访时间2～76个月，中位随访时间17个月。根据CAⅨ不同表达分组进行生存分析，结果提示CAⅨ阳性肝癌患者17个月总生存率为51.0%，CAⅨ阴性肝癌患者17个月总生存率为90.9%。Kaplan-Meier生存分析显示，CAⅨ阳性和阴性患者的总生存率差异有统计学意义(χ2=10.772，P<0.05，图2)。收集TCGA数据库中365例HCC患者，CAⅨ miRNA高表达90例，CAⅨ miRNA低/中等表达275例，Kaplan-Meier生存分析显示CAⅨ miRNA高表达的HCC患者总生存率低于低/中等表达者(P=0.000 45，图3)。

图2 CAⅨ表达与HCC患者总生存率的关系

图3 TCGA数据库中CAⅨ miRNA表达与HCC患者预后的关系

2.3 CAⅨ在转染后人肝癌细胞株HepG2中的表达HepG2细胞株转染CAⅨ过表达和干扰表达的siRNA 48 h后，qRT-PCR检测显示CAⅨ过表达组在HepG2细胞株中呈高表达，CAⅨ干扰表达组在细胞株中呈低表达，与阴性对照组相比差异均有显著性(P<0.05，图4)。

图4 CAⅨ在转染后人肝癌细胞株HepG2中的表达

2.4 过表达及低表达CAⅨ对肝癌细胞增殖能力的影响由HepG2细胞生长曲线可见，转染48 h后，CAⅨ过表达组细胞的生长受到明显促进，而CAⅨ干扰表达组受到明显抑制，在96 h两组的作用效果最为明显(图5)。提示CAⅨ的表达水平与肝癌细胞HepG2的增殖能力相关，siRNA干扰沉默HepG2细胞中CAⅨ的表达会抑制其增殖生长。

图5 CAⅨ过表达及干扰表达组对肝癌细胞增殖能力的影响

2.5 过表达及低表达CAⅨ对肝癌细胞侵袭、转移能力的影响迁移实验结果显示，CAⅨ过表达组比阴性对照组细胞二维水平迁移速度明显提高(P<0.05)，而CAⅨ干扰表达组比阴性对照组细胞二维水平迁移速度明显降低(P<0.05，图6)。侵袭实验中阴性对照组视野平均侵袭细胞数为190.4±10.5，CAⅨ过表达组的平均侵袭细胞数为279±14.04，比阴性对照组侵袭力上调，差异有显著性(P<0.05)，CAⅨ干扰表达组视野平均侵袭细胞数为140±6.8，比阴性对照组侵袭力下调，差异有显著性(P<0.05)。

图6 CAⅨ过表达组迁移速度高于阴性对照组、CAⅨ干扰表达组

3 讨论

缺氧是包括HCC在内的恶性肿瘤发展过程中普遍存在的现象，缺氧环境中一部分肿瘤细胞死亡形成坏死灶，而部分肿瘤细胞内部会发生一系列缺氧反应以适应和克服缺氧环境，主要包括无氧代谢增加、细胞凋亡抑制、新生血管形成、肿瘤局部浸润及转移能力增强等[4]。目前认为低氧诱导因子HIF-1α在缺氧反应的启动和调节中发挥重要作用，在HCC中HIF-1α被认为是其治疗的靶点，HIF-1α过表达与肝癌患者不良预后有关[5-6]。CAⅨ是HIF-1α的下游靶点之一，是可靠的组织缺氧标志物[3]。CAⅨ主要表达于正常组织中的胃肠道上皮、卵巢体表上皮、胰管细胞、毛囊细胞和胎睾丸中，通常定位于有高增殖能力的上皮，具有调节细胞增殖的作用[7]。研究表明，CAⅨ在人类多种恶性肿瘤中均存在过表达，包括肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、子宫颈癌、胃食管癌、结直肠癌、胆囊癌及软组织肉瘤等，并与患者的不良预后密切相关[8-19]。研究显示，CAⅨ参与介导的细胞外酸化与缺氧微环境中肿瘤细胞的成瘤转化、细胞外基质降解、细胞生长因子诱导、蛋白酶活化密切相关，并且可通过竞争性抑制β-catenin，从而降低E-cadherin在MDCK细胞中介导的细胞间黏附作用[20]。在子宫颈癌细胞株C33A中，CAⅨ可激活Rho-GTPase信号通路，通过与CA9-DKK1的相互作用及β-catenin信号通路的转录调节导致细胞黏附力减弱，活动力增强，从而促进肿瘤的侵袭转移[21]。

CAⅨ的表达在HCC中的研究较少。Luong-Player等[22]发现，CAⅨ仅在15%的HCC中表达，其表达可用于鉴别HCC和肝内胆管癌。Yu等[23]研究显示，CAⅨ在30.4%的HCC中表达，但CAⅨ免疫反应的范围和强度均与临床指标无关。Huang等[24]研究结果显示，CAⅨ是HCC独立的不良预后因子。Hyuga等[25]研究发现CAⅨ表达与肿瘤分化无显著相关性(117例)，多因素分析又显示CAⅨ的表达是HCC患者复发和预后的独立影响因素。

组织病理检查不仅是确诊HCC的金标准，其对HCC分化程度的判读及患者治疗、预后均发挥至关重要的作用，其分化程度越低代表肿瘤的增殖、侵袭及转移能力越强，患者预后越差。本实验结果显示，CAⅨ在35.8%的HCC中表达，但在癌旁组织中均阴性。随着肿瘤分化程度的不同，其阳性率差异有显著性，高分化组为10.0%(2/20)、中分化组为29.6%(8/27)、低分化组为70.0%(14/20)，以上结果表明CAⅨ表达升高并不是HCC发生的早期事件，且与HCC肿瘤的恶性发展及组织分化程度密切相关。随访结果显示CAⅨ阳性和阴性患者的总生存率差异有统计学意义，CAⅨ阳性患者的总生存率显著低于CAⅨ阴性患者，与TCGA数据库中CAⅨ miRNA表达及预后关系较为一致。CAⅨ可能成为HCC独立的不良预后因子用于病理诊断工作中，指导HCC患者治疗。

为进一步探讨CAⅨ对HCC增殖及侵袭/转移能力的影响，本实验利用CAⅨ过表达载体和siRNA转染肝癌细胞HepG2，通过CCK-8实验和细胞迁移/侵袭实验观察CAⅨ过表达和低表达时，其对肝癌细胞HepG2增殖和侵袭能力的影响。细胞增殖实验数据显示CAⅨ的表达水平与肝癌细胞HepG2的增殖能力相关，siRNA干扰沉默HepG2细胞中CAⅨ的表达会抑制其增殖生长；细胞迁移/侵袭实验数据显示CAⅨ的过表达能促进肝癌细胞HepG2的侵袭转移能力，且与阴性对照组细胞相比差异有统计学意义。推测随着HCC分化程度的降低，CAⅨ表达升高进一步促进肿瘤细胞的增殖、迁徙/转移能力。

综上所述，CAⅨ蛋白表达上调与HCC病理分化程度相关，其阳性率与肿瘤分化程度呈负相关，且CAⅨ高表达患者总生存率显著降低。细胞实验也显示，CAⅨ过表达可以显著促进肝癌细胞HepG2的增殖、迁徙/转移能力。由于CAⅨ在包括肝组织在内的其他正常组织中低表达或不表达，有望成为HCC临床诊断和治疗的新靶点。