刘 柳，吴淑华，李扬扬，许晓阳，何 双，温菲菲，郭宁杰，贾真真

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，目前以氟尿嘧啶为重要组份的联合化疗方案依然是临床诊疗指南推荐的中晚期结直肠癌患者的一线治疗方案[1]。有研究显示，在结直肠癌的临床治疗中，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)在抗肿瘤及明显提高患者生存时间的同时也产生了严重的耐药与毒副作用，甚至导致化疗过程的延迟与中断[2-5]。随着对肿瘤耐药机制的深入分析，对5-FU起关键代谢作用的二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD)引起学者的关注[6-7]，调控DPD的表达可能成为逆转5-FU耐药的新思路。转录因子在蛋白质启动转录过程中发挥重要作用。新近研究发现，热休克转录因子1(heat shock factor 1, HSF1)是一组结构和功能具有广泛同源性，并且普遍存在于真核生物细胞中的转录因子，HSF1不仅可启动热休克蛋白家族基因的转录，同时也可启动非热休克蛋白家族基因的转录。本实验采用免疫组化、Western blot和qRT-PCR法检测结直肠癌中HSF1、c-Jun、p-c-Jun与DPD的表达，分析其相关性，探讨四者与临床病理特征的关系及临床意义，为逆转临床5-FU耐药提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织标本 收集2013年1月～2014年12月滨州医学院附属医院病理科存档的具有完整随访资料的结直肠癌标本。纳入标准根据WHO(2019)消化系统肿瘤分类进行，由两位资深病理医师采用双盲法重新阅片诊断为原发性结直肠癌。所有病例均为首次手术治疗，术前均未行任何放、化疗，术后应用FOLFOX方案化疗。本实验收集结直肠癌138例，其中男性77例，女性61例；年龄32～89岁，平均67岁；肿瘤直径<5 cm者58例，≥5 cm者80例；组织类型：管状腺癌95例，管状-黏液腺癌14例，黏液腺癌29例；分化程度：高分化19例，中分化83例，低分化36例；浸润深度：累及黏膜及黏膜下层11例，侵犯肌层48例，侵及或浸透外膜者79例；有淋巴结转移者67例，无淋巴结转移者71例。每年进行电话或门诊随访，随访截至2019年12月或患者死亡，失访者不予入组。

1.1.2新鲜标本 收集2018年1～12月滨州医学院附属医院病理科接收新鲜的结直肠癌标本16例，取癌旁正常肠黏膜组织作对照，所有组织一部分即时液氮冻存，一部分置入10%中性福尔马林中固定。

1.1.3试剂 兔抗人HSF1(ab61382)、c-Jun(ab31419)、p-c-Jun(ab30620，Ser63磷酸化位点)及DPD(ab134922)抗体，均购自Abcam公司；羊抗兔/鼠Ⅱ抗(ab5878)购自福州迈新公司，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。Western blot实验所需试剂购自上海碧云天公司。qRT-PCR实验中RNAiso、RT试剂盒及PCR试剂盒，均购自Takara公司；特异性引物序列由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化EnVision法染色：将切片脱蜡至水，高压热修复抗原，3%H2O2去除内源性过氧化物酶，加一抗HSF1(1 ∶450)、c-Jun(1 ∶150)、p-c-Jun(1 ∶200)及DPD(1 ∶300)抗体4 ℃过夜，PBS水洗后加二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水透明，中性树胶封固。用已知HSF1蛋白阳性的正常睾丸组织、c-Jun及p-c-Jun蛋白阳性的乳腺癌组织、DPD蛋白阳性的肝癌组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2Western blot法 冰上提取组织蛋白，经BCA法蛋白定量后上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转膜并封闭，一抗HSF1(1 ∶5 000)、c-Jun(1 ∶1 000)、p-c-Jun(1 ∶1 000)及DPD(1 ∶2 000)4 ℃过夜，TBST洗去一抗后二抗(羊抗兔IgG，1 ∶1 000)孵育2 h，ECL曝光，用Quantity One软件分析目的蛋白和GAPDH的吸光度值，以目的蛋白与GAPDH吸光度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.2.3qRT-PCR检测 按照Trizol试剂盒说明书提取组织RNA并检测其浓度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下将RNA逆转录成cDNA。PCR反应采用SYBR Green相对定量PCR法，按照试剂盒说明书配置25 μL体系反应液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1000上进行扩增(表1)。反应条件：95 ℃ 30 s GOTO 39(合计40个循环)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。采用ΔΔCt法检测，样品相对表达量用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=结直肠癌ΔCt-正常结直肠黏膜组织ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。实验重复3次，结果取其平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 结果判读

1.3.1HSF1、c-Jun、p-c-Jun判读标准 三种蛋白主要表达于细胞核，以呈棕黄色为阳性，在低倍镜下观察10个独立视野，选取5个阳性细胞数最多的视野，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞百分率进行判断。(1)按阳性细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞百分率计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分结果相乘作为最终结果，≥4分为阳性，<4分为阴性。

1.3.2DPD判读标准 DPD主要表达于胞膜或胞质，在低倍镜下观察10个独立视野，选取5个阳性细胞数最多的视野，采用Image Pro 6.0软件进行半定量分析，检测视野阳性区域的积分光密度(IOD)值，取其平均值。统计所有视野的IOD值，总平均值为127.52±4.11，低于总平均值的判读为阴性，高于总平均值则为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。组间比较及蛋白表达与临床病理参数的相关性采用χ2检验；蛋白表达的相关性用Spearman相关性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，并以Log-rank法检验；采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌与正常黏膜中HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD的表达免疫组化检测结果显示：HSF1、c-Jun、p-c-Jun主要表达于细胞核中，DPD主要表达于细胞质中，其在结直肠癌组织中的阳性率分别为62.3%、71.0%、52.9%、67.4%，均高于正常黏膜组织(P<0.05，表2，图1)。Western blot结果显示：HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD在结直肠癌组织中的表达均高于正常结直肠黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。qRT-PCR检测结果显示：HSF1、c-Jun及DPD在结直肠癌组织中的相对表达量高于正常黏膜组织，其差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图1 A.HSF1在正常结直肠黏膜组织中呈阴性，EnVision法；B.HSF1在结直肠癌中呈阳性，EnVision法；C.c-Jun在正常结直肠黏膜中呈阴性，EnVision法；D.c-Jun在结直肠癌中呈阳性，EnVision法；E.p-c-Jun在正常结直肠黏膜组织中呈阴性，EnVision法；F.p-c-Jun在结直肠癌中呈阳性，EnVision法；G.DPD在正常黏膜组织中呈阴性，EnVision法；H.DPD在结直肠癌组织中呈阳性，EnVision法

图2 Western blot法检测HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD在结直肠癌和正常黏膜组织中的表达：A.电泳图；B.直方图，N.正常结直肠黏膜组织，T.结直肠癌组织

图3 qRT-PCR检测HSF1、c-Jun及DPD mRNA在结直肠癌和正常黏膜组织中的表达

表2 结直肠癌和正常黏膜组织中HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD的表达[n(%)]

2.2 结直肠癌中DPD蛋白表达与c-Jun、p-c-Jun、HSF1表达的相关性根据DPD的免疫组化染色结果，将138例结直肠癌组织分为DPD阳性组和DPD阴性组，分析HSF1、c-Jun、p-c-Jun与DPD蛋白表达的相关性。组间比较显示：DPD阳性组中HSF1、p-c-Jun的表达均高于阴性组，差异有显著性(P<0.05)；而c-Jun的表达差异无统计学意义(P>0.05)。χ2检验结果显示：结直肠癌中DPD与p-c-Jun、HSF1的表达均呈正相关(P<0.05)；DPD与c-Jun蛋白表达无相关性(P>0.05，表3)；HSF1与p-c-Jun的表达无相关性(P>0.05，表4)。

表3 结直肠癌中DPD与c-Jun、p-c-Jun及HSF1表达的相关性

表4 结直肠癌中HSF1与p-c-Jun表达的相关性

2.3 HSF1与p-c-Jun不同分组中DPD蛋白的表达根据HSF1与p-c-Jun的免疫组化表达将其分为4个亚组，分别为HSF1+/p-c-Jun+、HSF1+/p-c-Jun-、HSF1-/p-c-Jun+、HSF1-/p-c-Jun-。本实验采用免疫组化及Western blot法检测不同分组中DPD蛋白表达，并进行组间两两比较，分析组间DPD表达的差异性。本组结果显示，HSF1+/p-c-Jun+组中DPD阳性率高于其他三组，而HSF1-/p-c-Jun-组中DPD的表达低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.01)，在HSF1+/p-c-Jun-组中DPD的表达则高于HSF1-/p-c-Jun+组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表5，图4)。

表5 HSF1与p-c-Jun不同分组中DPD蛋白的表达[n(%)]

图4 Western blot法检测HSF1和p-c-Jun不同分组中DPD蛋白表达：A.电泳图；B.直方图

2.4 结直肠癌中c-Jun、p-c-Jun、HSF1及DPD的表达与临床病理特征的相关性结直肠癌中HSF1蛋白表达与浸润深度及淋巴结转移密切相关(P<0.05)；p-c-Jun蛋白表达与分化程度具有相关性(P<0.05，表6)。DPD蛋白表达与组织学类型及浸润深度密切相关，DPD在黏液腺癌及伴黏液腺癌成分的管状腺癌中的表达高于管状腺癌，差异均有统计学意义(P<0.05，表6)。

表6 结直肠癌中c-Jun、p-c-Jun、HSF1及DPD的表达与临床病理特征的相关性

2.5 生存分析138例结直肠癌患者中位生存时间为65.2个月，平均5年生存率为63.4%。Kaplan-Meier分析显示HSF1、DPD及淋巴结转移与结直肠癌患者预后密切相关(P<0.05)。HSF1、DPD阳性患者的5年生存率分别为23.3%和29.0%，低于HSF1、DPD阴性患者的5年生存率(78.8%、75.6%)；HSF1与p-c-Jun均阴性患者的预后较好，其5年生存率为85.2%，而HSF1、p-c-Jun均阳性患者的5年生存率为20.8%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，图5)。Cox回归模型分析显示HSF1、DPD及淋巴结转移是结直肠癌预后的独立危险因素(P<0.05，表7)。

图5 结直肠癌患者预后生存曲线：A.HSF1预后生存曲线；B.DPD预后生存曲线；C.HSF1和p-c-Jun不同分组预后生存曲线；D.淋巴结转移预后生存曲线

表7 结直肠癌患者预后Cox多因素生存分析

3 讨论

目前，结直肠癌的治疗以手术切除为主，对于术后和失去手术机会的结直肠癌患者，化疗依然是治疗的重要手段。目前，5-FU依然是Ⅲ期结直肠癌和部分具有高危因素结直肠癌患者的标准治疗方案。由此可见，控制5-FU的代谢状态及药代动力学对于确保临床疗效具有重要意义。参与5-FU代谢的酶主要有DPD、TS、TP等[8-9]，其中DPD作为5-FU代谢的起始和限速酶在众多5-FU代谢酶中倍受关注。DPD是由2个相同亚基与相对分子质量为10.5×104的分子组成的高二聚体酶，主要分布在肝脏、外周血单核细胞，炎性组织及正常组织中也有适量分布。DPD作为5-FU代谢的关键酶，其表达上调可加速5-FU在肝脏中的分解代谢，减少肿瘤药物浓度，从而降低抗癌效果[10-11]。文献报道，口腔癌、尿路上皮癌等多种肿瘤中均存在DPD异常表达，其表达增高可降低肿瘤细胞对5-FU的反应度，反之肿瘤组织对5-FU的敏感性提高[12-13]。有研究显示，结直肠癌中DPD高表达可降低5-FU的化疗敏感性，应用DPD抑制剂可提高5-FU的治疗效果[14-15]。本实验结果显示，结直肠癌中DPD mRNA及蛋白表达水平均高于正常结直肠常黏膜组，与其他学者的研究结果一致。本实验结果同时显示，DPD与患者的生存密切相关，并且在黏液腺癌中高表达。作者认为，结直肠癌中存在DPD的转录或转录后水平异常，导致其蛋白升高，影响肿瘤对5-FU的敏感性，产生化疗抵抗，在一定程度上影响临床疗效及患者预后。由此可见，深入分析结直肠癌中DPD的转录、表达变化规律及其调控机制，对临床个性化治疗具有重要意义，可成为逆转耐药的新思路。

DPD是由定位于染色体1p21-1p22区域的二氢嘧啶脱氢酶基因(dihydropyrimidine dehydrogenase gene, DPYD)编码，包括23个外显子，转录为含1 025个氨基酸的蛋白。研究表明，c-Jun、c-Fos、PU.1等多种转录因子均可参与DPYD启动转录为DPD的过程[16]。Ukon等[17]在HSC42和293T细胞中发现，由转录因子c-Jun参与组成的激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)在启动DPYD转录翻译中发挥重要作用，激活AP-1可启动DPYD的转录。其主要通过高度保守的碱性亮氨酸拉链(bZIP)形成同源或异源二聚体，与DNA结合参与多种生长因子和细胞因子的基因转录，从而调控肿瘤细胞的增殖、分化、转化、侵袭和耐药等过程。然而，在结直肠癌中关于转录因子与DPD的关系以及与临床药物疗效及预后的相关性尚缺乏深入分析。本实验结果显示，结直肠癌DPD阳性组中p-c-Jun表达高于DPD阴性组，而c-Jun表达差异无统计学意义；提示p-c-Jun有可能参与结直肠癌中DPYD的启动转录，增加DPD的表达。本实验结果显示，DPD与p-c-Jun的表达并不完全同步，在一部分DPD阳性病例中p-c-Jun呈阴性，这与以往其他报道不同。我们推测c-Jun对DPD的启动转录并非全部，可能有更多的转录因子参与其中。因此，进一步揭示DPD的转录机制，对于提高结直肠癌患者的疗效具有重要临床意义。新近研究发现，由c-Jun参与组成的AP-1蛋白不仅可通过bZIP蛋白形成同源或异源二聚体，还可与非bZIP蛋白以特定序列与其特定基因的启动子结合，如核转录因子NF-κB[18]、CREB结合蛋白[19]和HSF1[20]等，从而扩大AP-1家族蛋白的组合多样性和调控的基因范围，进而发挥激活或抑制作用。

HSF是一类能与HSE结合并调节细胞内热休克蛋白表达的反式细胞因子，可在外界刺激或病理状态下被激活，继而诱导热休克蛋白的表达。本课题组前期研究表明[20]，HSF1在结直肠癌组织中高表达，HSF1不仅可启动热休克蛋白基因家族的转录，同时也可启动非热休克蛋白的转录，如多药耐药基因MDR1的转录。Sawai等[21]研究发现，c-Jun、c-Fos启动子中均存在热休克反应元件HSE。在HaLe细胞中，经热刺激激活的HSF1可与c-Jun中的HSE结合，启动c-Jun转录翻译。Ciato等[22]在Cushing病的研究中发现，HSF1在抑制剂KRIBB11参与下通过与c-Jun、c-Fos启动子中的热休克反应元件HSE结合，抑制POMC启动转录，从而减少促肾上腺皮质激素ACTH分泌。然而，在结直肠癌中有关HSF1与c-Jun的关系鲜见报道。本实验结果显示，当结直肠癌中HSF1、p-c-Jun同时阳性时，DPD阳性率显著高于其他组；当HSF1、p-c-Jun同时阴性时，DPD阳性率显著低于其他组，且HSF1阳性组DPD的表达高于p-c-Jun阳性组；提示HSF1、p-c-Jun均与DPD的表达有关，且HSF1有可能直接调控DPD的表达。我们推测作为重要的转录因子HSF1可以与任何存在热休克反应元件的基因结合，启动其转录过程。由于c-Jun启动子中存在热休克反应元件，两者可能以AP-1家族蛋白组合的形式启动DPD转录，促进其高表达。HSF1对DPD的影响是否通过DPYD上的热休克反应元件来完成，还需进一步分析。

影响结直肠癌患者预后的因素众多[23-24]，本实验对HSF1、p-c-Jun、DPD的表达与结直肠癌临床病理特征的相关性进行分析，结果显示：HSF1蛋白表达水平与浸润深度及淋巴结转移密切相关；p-c-Jun蛋白表达水平与分化程度有相关性；DPD蛋白表达水平与组织学类型及浸润深度密切相关。Kaplan-Meier分析表明，HSF1、DPD及淋巴结转移均与结直肠癌患者预后密切相关。Cox多因素生存分析显示，HSF1、DPD及淋巴结转移是结直肠癌预后的独立危险因素。我们推测作为生物学功能广泛的转录因子，HSF1与c-Jun可以同源或异源聚体的形式，启动多种基因的转录过程，不仅参与肿瘤发生、发展，并且在5-FU起始和限速酶DPD的启动与转录过程中发挥重要作用，从而影响了结直肠癌的生物学行为以及5-FU的疗效。

综上所述，HSF1、c-Jun、p-c-Jun、DPD在结直肠癌中高表达，HSF1可能通过与磷酸化修饰的转录因子p-c-Jun结合，形成新的异源二聚体进而启动DPYD转录和翻译，也可能自身以同源聚体形式启动DPD的转录，导致结直肠癌中DPD升高，引起5-FU的耐药。HSF1、p-c-Jun、DPD表达分别与肿瘤分化程度、淋巴结转移等多种临床病理特征及预后密切相关，对结直肠癌化疗方案的选择以及判断肿瘤预后的个体差异均具有重要意义。然而，本实验仅对HSF1、c-Jun、p-c-Jun和DPD蛋白表达的相关性及其临床意义进行初步探讨，还需增加样本量进一步分析，并深入开展分子机制的分析，为临床个性化用药的选择及逆转结直肠癌耐药提供可靠依据。