解卫方 沈洪艳 郭志

(1.河北科技大学环境科学与工程学院 石家庄050018； 2.河北省药用分子化学重点实验室 石家庄 050018； 3.华北制药集团先泰药业有限公司 石家庄 052165)

0 引言

随着近年来我国制药行业不断快速地发展，相对应的制药行业废水排放量也在一直增加，在世界各国工业废水排放量中，我国的废水排放量占比高于工业生产占有率，占比为6%，而且我国大量生产使用抗生素，是世界上最大的抗生素生产国[1]。相关研究表明，生产出1 t抗生素药品就会产生150～200 m3的制药废水[2]。抗生素类药品生产废水中残存大量的有机溶剂、微量元素以及杀菌、抑菌等有毒物质，影响水中水生生物的正常代谢和一系列的生理功能[3]。

近年来国内外研究者已在抗生素对水生生物的影响方面做了全面而深刻的研究，尤其是水生生态系统受抗生素影响的研究报道不断增多。李伟民等[4]首先报道了氯代苯胺对斑马鱼的急性毒性；吴志刚等[5]基础性地报道了青霉素废水会对斑马鱼机体造成了一定的氧化损伤；因此，本论文所研究的毒理实验有实际意义，并且可为后期阿莫西林制药废水的深度处理技术提供毒理学依据。

本实验使用的废水来自石家庄市开发区某制药厂污水处理厂的进水(车间排放的废水)，选用斑马鱼为受试生物，进行制药废水对斑马鱼的毒性实验研究。本实验重点研究了阿莫西林废水对斑马鱼肌肉组织细胞中T-AOC、CAT活性的影响。

1 实验方法

1.1 实验设计

预实验：随机取6条斑马鱼放入5 L的鱼缸中，根据查阅文献的记载，初步设定废水质量分数为20%、40%、60%、80%、100%，实验结果表明，在实验进行31 min时，在质量分数20%的暴露组实验中观察到斑马鱼开始死亡，在实验进行36 min后，观察到实验所用的斑马鱼全部出现死亡现象，根据上述实验出现的现象，预实验又增加了质量分数为0.5%、1%、5%、10%的暴露组。实验进行96 h，最终得出24 h斑马鱼全部死亡的实验所用阿莫西林制药废水的浓度和96 h内斑马鱼未出现死亡现象的阿莫西林制药废水浓度。

急性实验：按照上述进行预实验时所得出的实验结论，选用质量分数分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的暴露组进行急性实验，实验设定5个暴露组和1个对照组，每组随机同时取10条健康的斑马鱼放入实验所用鱼缸中，实验共进行96 h，观察斑马鱼所出现的症状及不同时间的死亡条数，最终得出斑马鱼的24 h半数致死浓度。

亚急性实验：依据上述急性实验所得出的实验结论，亚急性实验同样分别设置对照组1组和暴露组5组，选用废水体积分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每个实验组随机、同时选14条健康外观正常的斑马鱼放入实验所用鱼缸中，实验总进行15 d，分别在实验进行到第3、6、9、12、15 d时，随机捞取2条斑马鱼，用消毒的医用剪刀对实验组中的斑马鱼进行解剖并取其肌肉组织部分，用生理盐水进行浸泡，在放进冷却的玻璃匀浆器中，在冷却条件下研磨捣碎，再用离心机进行分离，取上清液再按照试剂盒使用方法对上清液进行配制，最后用紫外分光光度计对斑马鱼肌肉组织的T-AOC和CAT活性进行测定分析。

1.2 实验废水

阿莫西林废水呈黄色，无刺鼻性气味，取来后放在0～4 ℃的冰柜中储存备用。实验前对水样的常规水质指标进行了测定，测定结果见表1。

表1 阿莫西林废水水质测定结果 mg/L(pH值除外)

1.3 实验设备、实验生物、数据处理

实验设备有酸度计(FE20)、UV2550紫外分光光度计、5 L鱼缸、台式冷冻高速离心机、曝气泵；不同量程的设备有移液枪、分析天平、电热恒温水浴锅、玻璃匀浆器、量筒、温度计、溶解氧测定仪(JPBJ-608)、水质硬度计(YD300)等。

受试生物斑马鱼来源于河北医科大学实验室动物中心，体长为25±3 mm，体重0.20±0.05 g，实验前驯养1周，斑马鱼的自然死亡率应小于5%。

数据统计结果用平均值±标准偏差表现。采用Origin 8.0软件进行空白组和暴露组的显著性分析[6]。

2 结果与分析

2.1 阿莫西林制药废水水质指标测定

实验前对废水的COD、TOC、氨氮、pH值等常规指标进行了测定，测定结果及所用仪器见表1。

实验结果表明，除氨氮外，阿莫西林废水中COD、TOC均超标，与限定值对比，实验结果分别为限定值的150倍和169倍，废水pH值为4.46，为酸性溶液，实验时需将溶液的pH值调至中性。

2.2 阿莫西林制药废水对斑马鱼T-AOC活性的影响

T-AOC在生物体内的活性水平大小代表着生物机体的代谢退化与生命衰亡[7]。实验结果见图1。

图1 实验对斑马鱼T-AOC活性影响

第3天，质量分数0.1%、0.4%、0.5%的实验组与对照组比较，未呈现出显著性差异(p>0.05)，可能由于第3天实验时间较短，明显的中毒迹象还未在斑马鱼机体中表现出来；质量分数0.4%、0.5%的暴露组的胁迫已经使得斑马鱼抗氧化防御系统受到了不可逆的变化，从而破坏了受试生物机体内的抗氧化平衡状态[8]。质量分数0.2%、0.3%暴露组与对照组相比，斑马鱼肌肉组织中的T-AOC活性呈现出了显著性诱导的现象(0.01

第6天，质量分数0.1%、0.5%实验组与对照组比较并未呈现出显著性差异的现象(p>0.05)，出现这种现象可能与第3天质量分数0.1%、0.5%暴露组对照组对比无显著性差异原因相同，质量分数0.1%暴露组斑马鱼机体还未做出应激反应；质量分数0.5%暴露组已超过斑马鱼机体可承受的范围；第6天，质量分数0.2%、0.3%、0.4%实验组与对照组比较表现出了显著性差异(0.01

第9天和第12天，实验组与对照组比较并未呈现出显著性差异的现象(p>0.05)，可能是机体内总抗氧化能力在此时处于动态平衡，体内产生的活性氧自由基能够及时被抗氧化酶进行消除[10]。

第15天，质量分数0.3%暴露组同对照组相比呈现显著性诱导(0.010.05)，可能由于暴露时间较长，斑马鱼的抗氧化平衡状态已经受到毁坏，抗氧化酶也已失去活性。

2.3 阿莫西林制药废水对斑马鱼CAT活性的影响

CAT可与谷胱甘肽过氧化物酶等一起清除机体内H2O2，减缓自由基对生物体的氧化伤害[7]，因而其在生物体抗氧化防御系统中占有很重要位置[12]，实验结果见图2。

图2 实验对斑马鱼CAT活性影响

第3天和第6天，实验组中CAT活性与对照组比较未呈现显著差异(p>0.05)，可能在实验初期(第3天、第6天)，污染物质胁迫还未使得斑马鱼机体出现中毒迹象。

第9天和第12天，质量分数0.1%试验组与对照组比较，CAT活性未呈现显著性变化，因为质量分数0.1%的废水浓度较低，还未使斑马鱼产生应急反应；质量分数0.2%、0.3%、0.4%暴露组与对照组相比，CAT活性有所上升，斑马鱼体内活性氧原本的平衡状态被外源物质的进入所破坏，从而受刺激的机体会产生一些自主的氧化应激反应；产生应激反应就会消耗机体内的CAT物质，进而加快斑马鱼体内的过氧化氢分解，从而可以消除受试生物体内的氧自由基，使机体免受过氧自由基的损伤[12]；质量分数0.5%实验组与对照组比较，CAT活性未呈现显著差异，可能由于外援物质的刺激清除了机体内抗氧化自由基[13]，使机体抗氧化防御系统处于一个平衡状态。

第15天，实验组与对照组对比未呈现出来一些显著性差异(p>0.05)，可能实验第15天斑马鱼体内CAT代谢H2O2能力达到饱和状态，H2O2的积累量促使鱼体细胞产生中毒现象，使得其清除活性氧的性能丢失[5]。

2.4 阿莫西林制药废水对斑马鱼T-AOC和CAT活性影响对比

斑马鱼暴露在阿莫西林废水中T-AOC和CAT活性变化呈现“抑制—诱导—抑制”的变化趋势；T-AOC、CAT活性在质量分数0.3%暴露组时达到最大；质量分数0.2%、0.3%、0.4%暴露组与对照组比较，T-AOC的活性呈现显著性诱导(0.01

3 结论

阿莫西林废水胁迫下斑马鱼肌肉组织内T-AOC和CAT活性发生了变化，表明斑马鱼机体已经对阿莫西林废水的刺激做出了应激反应。

斑马鱼的抗氧化防御系统可承受的最大质量分数为0.3%，超过0.3%斑马鱼的抗氧化防御系统就会遭到影响。

斑马鱼的抗氧化防御系统指标T-AOC和CAT活性之间成协同作用，且在受到相同质量分数的阿莫西林废水胁迫时，与CAT活性与T-AOC的活性比较变化较为显著，可以较好地反映斑马鱼在阿莫西林废水中所遭到的氧化胁迫状态。