李娟娥，姜小帆，南晓强，刘沈楠，吉海旺，雷 鹏△

1.陕西省人民医院(西安710068)；2.陕西中医药大学(咸阳712046)

高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)与痛风(Gout)是嘌呤代谢障碍引起的代谢性疾病，痛风除高尿酸血症外，还可表现为急性关节炎(Acute gouty arthritis，AGA)，其主要表现为关节及周围软组织的红、肿、热、痛，病情严重者出现关节破坏。随着我国经济的发展和人民生活方式的改变，高尿酸血症和痛风的发病率逐年上升。祖国医学经过数千年的发展历程,对痛风的防治形成了较为完整的理论体系和丰富的临床经验，但缺乏广泛深入的相关机制研究和高证据的临床研究。我们的前期实验研究和临床应用均发现息痛散具有降低血清尿酸和缓解急性痛风性关节炎症状的作用[1-2]，主要与降低炎性因子有关，但对降低血尿酸及筛选炎症信号通路的靶点研究尚待进一步明确。本研究通过关节腔注射尿酸钠晶体及腹腔注射氧嗪酸钾溶液建立HUA+AGA大鼠模型，观察息痛散对急性痛风性关节炎大鼠的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：清洁级Wistar雄性大鼠60只，12周龄，平均体重(250±20)g。3只大鼠为一笼饲养。饲养温度(23±2)℃,湿度(55±10)%,每日12 h光照维持,昼夜循环。各组大鼠均常规饲养，并自由摄水、进食。动物由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物与试剂：氧嗪酸钾(批号：2207-75-2)、尿酸钠(批号：U2875-5G)、秋水仙碱(批号：H20113208)。Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)抗体(批号：ab74279、ab175315、ab16502)。ELISA试剂盒、TGF-β1(型号：HLE20746)、IL-1β(型号：HLE20024)、IL-10(型号：HLE20095)、Histamin(型号：HLE20597)。息痛散颗粒(由三九药业提供中药免煎颗粒)。

1.3 实验仪器：酶标仪multiskan mk3型(Labsystems dragon公司)、高速冷冻离心机TGL-16、湘仪DYY-7C型电泳仪、恒温培养箱DHP-9052型。

2 实验方法

2.1 动物分组：将60只Wistar大鼠按体重分层，采用Excel随机方法将大鼠分出12只为正常组，其余均复制模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组、息痛散低剂量组、息痛散高剂量组，每组12只。所有大鼠均分笼饲养，每笼6只，自由摄食、饮水，并定期清洁、消毒。

2.2 药物配制方法：将3 g氧嗪酸钾晶体溶于97 ml生理盐水中配成3%氧嗪酸钾溶液；1250 mg尿酸钠结晶加45 ml生理盐水中，再加5 ml吐温80，配成25 mg/ml的尿酸钠溶液50 ml，0.22 μm密理博除菌滤器过滤除菌。

2.3 模型建立：按1 ml/100 g的剂量将3%的氧嗪酸钾进行大鼠腹腔注射，2次/d，连续注射7 d，构建HUA模型。第4天采用2%的戊巴比妥钠将大鼠麻醉，从右侧踝关节背侧按30°～45°方向插入胫骨肌腱内侧，将0.2 ml的尿酸钠溶液注射入关节腔内，诱导AGA模型，如关节有明显肿胀，即表明模型复制成功[3-4]。

2.4 给药方法：给药剂量根据“人与动物体表面积换算的等效剂量” 进行换算[5]，秋水仙碱组、息痛散高剂量组和息痛散低剂量组的用药剂量分别为0.3 mg/(kg·d)、72 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)，正常组及模型组给予等体积生理盐水。构建AGA模型24 h后给药， 2次/d，连用10 d均为灌胃治疗。

2.5 大鼠足跖肿胀度的测定：以上各组于治疗前、治疗后4、12、24、48 h测定各组鼠足容积[5]。足跖肿胀率=(给药后足容积-给药前足容积)/给药前足容积×100%。

2.6 标本留取：治疗第5天各组均取6只大鼠，末次给药2 h后，按0.3 ml/100 g剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液，大鼠麻醉后，腹主动脉取血，4000 r/min，离心10 min，分离血清，检测血清尿酸及血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量。取右踝关节，留拍关节大体图片、关节腔内图片、关节面图片。关节组织获取后取一部分放置于4%多聚甲醛溶液固定后行HE染色；另一部分将滑膜组织切成小块放于EP管，迅速投入液氮中，用于Western blot检测。剩余每组6只大鼠于治疗10 d后，同上处理。

2.7 Western blot检测:取一定量冻存滑膜组织，加入400 μl PMSF的RIPA蛋白裂解液于冰上匀浆制备样品，10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白；PVDF膜转膜约90 min。用TBST配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1 h。一抗孵育：将封闭液按照1∶500稀释；二抗孵育：用封闭液按照1∶3000稀释HRP标记二抗,孵育2 h。用ECL试剂盒反应,X光片压片、显影、定影,并用Lab Works软件对图像进行灰度分析。

2.8 大鼠踝关节滑膜组织的病理形态学变化:用4%多聚甲醛溶液固定滑膜组织，分别进行脱钙和脱水后石蜡包埋，切片后行HE染色，于显微镜下观察大鼠踝关节滑膜组织的病理形态学变化。

结 果

1 各组大鼠足跖肿胀率比较 给药后4 h，各组足跖肿胀率均升高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。秋水仙碱组足跖肿胀率减轻，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，息痛散低剂量与高剂量组均有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。给药后12 h，各组足跖肿胀率升高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，秋水仙碱组和息痛散高剂量组足跖肿胀率均减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。给药后24 h，各组足跖肿胀率均高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各给药组足跖肿胀率减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。给药后48 h，与正常组比较，各组关节肿胀度均高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组足跖肿胀率均低，差异有统计学意义(P<0.05)。综上说明，各给药组均可减轻HUA+AGA大鼠模型的关节肿胀度，秋水仙碱约从4 h开始起效，息痛散组约12 h开始起效。见表1。

表1 各组大鼠足跖肿胀率比较(%)

2 各组大鼠血尿酸水平比较 治疗5 d后，与正常组UA(98.20±15.20)μmol/L比较，模型组尿酸(Uric acid,UA)(287.56±35.23)μmol/L、秋水仙碱组UA(265.37±31.02)μmol/L、息痛散低剂量组UA(258.87±36.42)μmol/L、息痛散高剂量组UA(248.12±25.87)μmol/L均高，差异有统计学意义(P<0.01)。说明采用腹腔注射氧嗪酸钾方法可以成功构建HUA模型。各药物治疗组中血清UA与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 各组大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量比较 与正常组相比，模型组和各药物治疗组大鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量均有差异，具有统计学意义(P<0.01)。治疗5 d和10 d时秋水仙碱组血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。治疗5 d时息痛散高剂量组与模型组比较，各项指标均有统计学差异(P<0.05)，而息痛散低剂量组的IL-1β、Histamin含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗10 d时，息痛散低剂量组IL-1β、IL-10与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平比较(ng/ml)

4 各组大鼠滑膜组织内Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)表达比较 通过Western blot检测，治疗5 d后各药物治疗组大鼠滑膜组织内Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗10 d后，秋水仙碱组和息痛散高剂量组Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表达与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，而息痛散低剂量组，各指标差异，无统计学意义(P>0.05)。见表3(图1)。

表3 各组大鼠滑膜组织内Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表达比较

A：模型组；B：息痛散低剂量组；C：息痛散高剂量组；D：秋水仙碱组

5 各组大鼠关节滑膜组织病理形态学情况 通过HE染色观察到，治疗10 d时模型组大鼠滑膜组织即出现炎性病变，关节腔积液显著增多，滑膜组织充血、水肿，可见大量的淋巴和单核细胞浸润，关节软骨表面光滑，未见明显颗粒；与模型组相较，秋水仙碱组及息痛散高剂量组关节腔积液明显减少，滑膜组织轻度充血、水肿，可见少许炎性细胞浸润；息痛散低剂量组与模型组比较，区分度不显著(图2)。

A：模型组；B：秋水仙碱组；C：息痛散低剂量组；D：息痛散高剂量组

讨 论

痛风是长期嘌呤代谢障碍、血尿酸增高导致单钠尿酸盐沉积于骨关节，引发的急、慢性炎症和组织损伤[6]。目前，研究认为急性痛风性关节炎主要与TLR4/NF-κB的炎性信号通路有关。NF-κB是一种DNA结合蛋白因子，参与不同促炎分子和不同酶的转录，如细胞因子、趋化因子、细胞黏附等。当MSU沉积于细胞外时，与细胞膜上的Toll样受体结合，活化NF-κB，进一步激活NLRP3炎症小体，诱导pro-Caspase-1自我剪切为活化的Caspase-1，进而活化IL-1β、IL-18，激活下游的一系列炎症反应[7-8]。IL-10是一种抑制软骨分解的细胞因子[9]，可直接抑制破坏软骨的IL-1和TNF-α等炎性因子的合成。

中医学将本病纳入“骨痹、痹证、筋痹、历节风、白虎历节”等范畴，主要因先天脾肾不足，或七情损伤、或饮食不当、或关节外伤，致痰浊内聚，或加之外感邪气，形成热毒、痰浊、瘀血滞留肢体筋脉关节，形成红、肿；焮热及剧痛[10-11]。息痛散由石膏、忍冬藤、黄柏、苍术、牛膝、桃仁、全蝎等组成。方中生石膏，辛甘性寒，清透肌肤骨节郁热；忍冬藤清热解毒、宣泄风热，两药共为君药；苍术燥湿健脾，黄柏清热燥湿，合为臣药；桃仁、全蝎活血化瘀、通络止痛；川牛膝祛风除湿、疏经通络，且引药下行，使诸药直达病所。全方共奏清热泻火、祛瘀通络、燥湿化痰之功。

近年来，中药复方治疗AGA研究比较多，证实清热祛湿、通络止痛的中药复方具有消炎止痛的作用，可以改善患者的关节疼痛等症状[12]，但目前大部分研究仅停留在药效学方面，缺乏深入的机制研究[13-14]。本研究发现息痛散可以减轻HUA+AGA大鼠模型关节肿胀度，改善滑膜组织的炎性反应，调节血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平，降低踝关节滑膜组织中Caspase-1、TNF-α、NF-κB蛋白的表达，其作用机制可能与TLR4/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎性体激活有关。高尿酸血症是导致AGA的主要因素，故本研究采用的是高尿酸血症+急性痛风性关节炎模型，更符合人类急性痛风性关节炎的发病机制，但可能由于采用的是急性炎症期模型，故对关节软骨暂未形成明显破坏，需要日后进一步完善。