吴沂旎，吴宁玲， 庄曾渊

1.陕西省中医医院(西安 710003)；2.中国中医科学院眼科医院(北京 100040)

川芎嗪被广泛应用于视网膜、视神经缺血性疾病的治疗，药理研究发现川芎嗪是从川芎根茎中分离出的生物碱单体，又名四甲基吡嗪，可抵抗交感神经的血管收缩、促进血液循环、抑制血小板聚集反应、阻抑血栓形成，调节各种血管活性物质的释放[1]。然而，对于缺血性眼底病的作用机理尚未明确，目前欠缺合理用药的依据。近几年大量研究证实，因各种原因导致的眼底缺血性疾病与眼底视网膜、脉络膜血管内皮细胞受损及其血管相关活性因子失调相关[2]。因而，研究保护眼底血管内皮细胞作用机理，预防其功能损伤是预防这类疾病优选方案。本实验目的在于通过观察川芎嗪对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞(Retinal vascular endothelial cell，RVEC)血管舒缩因子的作用，进而为不同的缺血性眼底病变提供实验及理论根据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验试剂：DMEM培养基(美国GIBCO公司)、胎牛血清(四季青公司)、生长因子(中日友好医院细胞实验室)、盐酸川芎嗪注射液(规格：40 mg，郑州卓峰制药有限公司)、牛视网膜血管内皮原代细胞(购于北京中日友好医院细胞库)、谷氨酰胺、双抗、肝素(上海西唐生物科技有限公司)、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)兔抗人多克隆抗体(Abcam公司)、内皮素-1(ET-1，Endothelin-1)、兔抗人多克隆抗体(Acris生物技术公司)。

1.2 仪器与设备：倒置显微镜(日本Olympus公司)、ELX808 酶标仪(美国Bio-Tek公司)、伯乐电泳仪、转膜仪(美国Bio-RAD公司)、匀浆器(型号：PRO200，美国PRO公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养：将牛视网膜血管内皮原代细胞复苏，从液氮中取出细胞冻存管，直接浸入37 ℃水浴锅中，快速震摇使其预热解冻，将解冻后的细胞悬浊液移入离心管中，转速1000 r/min，常温下离心5 min，弃去上清液，加入DMEM完全培养液[含200 g/L FBS、100 mg/L内皮细胞生长添加剂(Endothelial cellgrowth supplemen，tECGS)、100 mg/L肝素以及1 g/L双抗]，静置后移入明胶包被的培养瓶。置于5%的CO2，37 ℃的培养箱中。次日待细胞贴壁后更换培养液。观察贴壁细胞生长至80%融合度便可传代1次，选取第6代细胞进行分组实验。

2.2 实验分组：选取长势较好，贴壁达80%的细胞，按1∶3比例传代培养。待48 h细胞贴壁生长，呈梭形或扁平形，细胞紧密连接，呈鹅卵石样镶嵌排列时，加入PBS溶解的 CoCl2100 μmol/L进行缺氧诱导培养12 h；随机分为三组。缺氧对照组:不含药物、无生长因子及血清的培养液组。川芎嗪0.02 μg/ml组：缺氧组+含终浓度为0.02 μg/ml川芎嗪的培养基。川芎嗪0.2 μg/ml组：缺氧组+含终浓度为0.2 μg/ml川芎嗪的培养基。

2.3 MTT法检测各组的吸光度值：收取分组好的细胞悬浊液，将密度调至2×105个/ml，种于96孔板上,每孔200 μl,培养24 h后，每孔加入20 μl MTT，培育4 h后,弃去上清液及培养基,每孔加入二甲亚砜150 μl,在摇床上震荡8 min打匀,待蓝色结晶充分溶解,用自动酶标仪 (波长562 nm) 测定各孔光吸光度A值。实验重复测量4次。

2.4 Western blot法检测各组RVEC内eNOS、 ET-1蛋白的表达：取分组收集的细胞分别移入1、2、3号离心管内，并加入100 μl裂解液，将离心管放入冰盒内孵育20 min，12000 r/min离心，20 min后提取上清液，分装。将做好标记的96孔板内分别加入稀释好的1～3号 BCA标准品和待测蛋白样品各25 μl，每孔加入200 μl BCA工作液，充分混匀后至37 ℃孵育30 min，冷却后用酶标仪测定562 nm处的吸光度值，计算样品中的蛋白浓度。在收集蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE上样缓冲液混匀，放入沸水中加热5 min，冷却后，3000 r/min，30 s后离心备用。将SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上，放入封闭液内封闭1 h。将膜放入一抗( NOS 1∶100，ET-1 1∶1500)内，4 ℃孵育过夜。TBST液洗10 min，4遍，按(1∶10000)稀释二抗，把膜放入二抗内，孵育50 min。TBST液冲洗6次，ECL试剂显色曝光，冲洗显示条带，电泳条带密度值以灰度值表示，并以β-actin作为内参照。信号强度用IMAGEJ图像分析软件进行定量分析。

结 果

1 各组细胞生长状态 本实验细胞传代培养，细胞长势良好，细胞贴壁生长1 d后，呈梭形或扁平形，细胞透亮，活性良好，细胞紧密连接，呈鹅卵石样镶嵌排列；加入CoCl2100 μmol/L进行缺氧诱导，细胞数量明显减少，缺氧在多方面造成血管内皮细胞的损伤，生长受到抑制，可见细胞膜受损，细胞排列密度降低，部分细胞脱落甚至凋亡，造模成功；在缺氧受损的细胞中分别加入川芎嗪浓度为0.02、0.2 μg/ml的药液，细胞密度逐渐增高,凋亡细胞明显减少,细胞排列较缺氧组密集(图1)。

2 MTT法检测各组细胞增殖情况 缺氧对照组及川芎嗪各组的吸光度值均较正常细胞组低，差异有统计学意义(P<0.01)。川芎嗪0.02 μg/ml组、0.2 μg/ml组细胞的吸光度值明显高于缺氧对照组 (P<0.01)，且川芎嗪0.2 μg/ml组的吸光度值高于川芎嗪0.02 μg/ml组(P<0.01)，即与浓度呈正相关性。见表1。

A：正常细胞组；B：缺氧对照组；C：川芎嗪0.02 μg/ml组；D：川芎嗪0.2 μg/ml组

表1 MTT法检测各组在缺氧状态下RVEC增殖情况比较

3 各组eNOS、ET-1蛋白表达结果 采用LSD方法进行比较。与缺氧对照组相比，川芎嗪0.02 μg/ml组及0.2 μg/ml组的eNOS蛋白表达均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且川芎嗪浓度与蛋白表达呈正相关；两组川芎嗪组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。与缺氧对照组相比，川芎嗪0.02 μg/ml组及川芎嗪0.2 μg/ml组的ET-1蛋白表达均下降，各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，但两组川芎嗪组间ET-1蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2(图2)。

表2 各组eNOS、ET-1蛋白表达及平均灰度值比较

1：缺氧对照组；2：川芎嗪0.02 μg/ml 组；3：川芎嗪0.2 μg/ml 组

讨 论

川芎味辛、温，入肝胆、心包经。川芎嗪是川芎根茎中分离的有效成分，属吡嗪类生物碱。川芎嗪具有抗凝、抗血栓形成、扩张血管、降低血黏度、改善微循环等作用。眼科领域中川芎嗪对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用，主要通过减少细胞凋亡、抗氧化自由基作用、改善血液流变作用、Ca2+离子通道阻滞剂的作用来实现[3]。因此，川芎嗪被广泛应用于闭塞性血管疾病、缺血性心脑血管疾病。此外，还有研究发现川芎嗪能阻抑非酶糖化终末产物的形成，降低视网膜组织中血管内皮生长因子过度表达，从而防止新生血管不断生成，改善眼底血管组织缺血缺氧状态[4]。目前已经有川芎嗪对牛肺动脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞保护作用的研究[5]，但对视网膜血管内皮细胞的作用研究甚少。邓新国等[6]通过腹腔静脉注射盐酸川芎嗪实验检测分析兔眼视网膜组织的药代动力学，该实验证明川芎嗪能够渗入血视网膜屏障进入眼底视网膜，该结论为川芎嗪能全身用药治疗视网膜血管病变及眼底缺血性疾病提供了理论依据。

血管内皮细胞作为血液与血管平滑肌细胞之间的机械屏障，是人体最重要的内分泌器官[7]，容易受到体内外各种致病因素损伤，损伤后其分泌活性物质之间的平衡被打破，从而引起血管功能系统障碍[8]。血管内皮细胞主要分泌两种活性物质：舒血管物质，如NO、前列环素、内皮源性舒张因子等；缩血管物质，如内皮素、血管紧张素Ⅱ、内皮细胞收缩因子等。其中NO和ET-1是反映血管内皮细胞受损程度最可靠、最直接的标志[9]。生理情况下ET-1具有内皮细胞最强的收缩作用，可使血管收缩、管腔狭窄、血流缓慢、外周阻力增加；而NO可抑制血管内皮素的分泌，舒张血管，增加局部血流，抑制血小板的活化和凝集[10]。二者作为平衡使者，维持着血流量的相对稳定和血管床的静息舒缩状态。缺氧环境下可引起视网膜血管多方面病理变化，如新生血管形成、血管渗透性增加、视网膜神经节细胞损伤最终引起视觉功能丧失等。缺氧在多方面造成血管内皮细胞的损伤[11]。此时一氧化氮含量减少、ET-1释放增多，二者平衡失调，致使血管舒缩功能紊乱，促使眼底视网膜病变的发展。

NO作为内皮源性舒张因子,具有扩张血管和调节内皮细胞功能的作用，由限速酶NOS催化L-精氨酸脱胍基生成。NOS有三种亚型，其中eNOS分布于血管内皮细胞，它产生的NO更接近血管平滑肌，可以激活血管平滑肌中的可溶性鸟苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度升高，从而起到扩张血管、抑制血小板凝集作用[12]。eNOS活力水平直接影响NO的合成。NO为小分子气体物质不易检测，我们通过检测NO合成的eNOS，间接检测NO的表达[13]。本研究中川芎嗪各药物组血管内皮细胞eNOS的表达均升高，与缺氧对照组比较有统计学差异，且随着药物浓度增加蛋白含量增加；说明川芎嗪通过增强eNOS的活性来促进NO的分泌合成，从而扩张血管、抑制血小板凝集。在本实验中，川芎嗪能显著上调 eNOS的表达，可以推断川芎嗪逆转缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的损伤，其部分机制是通过上调eNOS的表达，从而增加内皮血管产生NO介导的。

ET是一种内源性长效血管收缩因子，用来调节血管紧张性及局部血液循环的缩血管活性肽。ET具有4种异构体。其中缩血管作用最强的是ET-1[14]。在心脏和血管上有丰富的ET-1受体，ET-1与组织中相应受体结合，激活第二信息cGMP，继发三磷酸肌醇水平增高，诱导细胞内Ca2+增高，使Ca2+内流，血管收缩。最终导致组织缺血、缺氧，自由基产生，导致细胞的凋亡和坏死。视网膜血管内皮细胞受损是缺血性视网膜病变的一个突出特点。近年来研究报道糖尿病患者血浆中ET-1呈现高浓度状态，正常眼压性青光眼患者血浆ET-1水平较健康对照组明显升高。视神经炎、视网膜静脉阻塞、球后视神经炎等缺血性眼病患者血浆ET-1水平升高[15]。本实验结果显示：川芎嗪能显著降低ET-1蛋白的表达，与对照组相比差异有统计学意义，且呈浓度负相关性，与前期临床实验一致；说明川芎嗪可抑制缺氧状态下视网膜血管内皮细胞分泌ET-1，减轻血管收缩，从而改善眼部缺血病理状态，减轻细胞损伤。

我们在本实验中发现川芎嗪可以改善缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的活性，对细胞的增殖有一定促增长作用。本实验研究表明川芎嗪组能促进视网膜血管内皮细胞分泌eNOS、减少ET-1生成，并呈现浓度依赖关系。说明川芎嗪能通过上调NO抑制血管内皮素的分泌，舒张血管增加局部血流；同时抑制ET-1的分泌减轻血管收缩，减少外周阻力；从而维持血管内皮细胞舒缩血管物质的动态平衡。可以推测因缺血缺氧导致血管内皮细胞损伤从而引起严重的眼底病变，川芎嗪可在一定程度上阻断内皮细胞受损导致的部分病理变化，从而减轻小血管痉挛，增加视网膜血液供应，改善患者视功能，可望为治疗这类眼部疾病提供新的实验依据。