赵 磊， 段旭彤， 王夏璐， 邹积宏*

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心， 黑龙江 哈尔滨 150500; 2.黑龙江大学 生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080; 3.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016; 4.沈阳药科大学 医疗器械学院，辽宁 沈阳 110016)

昆虫在自然界中分布广泛，种类繁多，不具备获得性免疫而仅依赖进化保守的先天性免疫应答抵御病害，从而维持机体自身的平衡[1]。昆虫先天性免疫系统由体液免疫和细胞免疫组成。其中，体液免疫主要包括由酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidase activating system, PPO-AS)介导的黑化反应及由Toll、免疫缺陷(immune deficiency, IMD)、JAK/STAT等信号通路介导的抗菌肽合成；细胞免疫包括由血细胞参与的吞噬、包囊、结节形成等。2种免疫反应相辅相成、协同合作，共同防御真菌、病毒、细菌等病原微生物的侵染[2-3]。

随着对昆虫先天性免疫系统了解的不断深入，研究发现，免疫应答反应强烈的昆虫有时会出现肠道菌群紊乱、神经退变、生存期缩短等现象[4-5]。究其原因，发现与昆虫免疫应答的过度激活相关。以PPO-AS介导的黑化反应为例，当病原体入侵诱导昆虫体内PPO-AS激活后，适量产生的黑色素可将入侵病原体包裹起来以防止其在昆虫体内扩散和繁殖，并通过形成的黑色素将病原菌杀死，对机体起到保护作用。当黑化反应过度激活时，过量产生的奎宁等物质将对昆虫自身的组织功能造成损伤，甚至导致死亡[6]。因此，昆虫免疫应答的激活强度和持续时间必须受到严格和精密的调控。近年来，昆虫免疫负向调控机制及其相关调控因子逐渐成为免疫学研究的热点。目前，已发现并鉴定出多种昆虫免疫负向调控因子，根据调控的不同免疫阶段，从丝氨酸蛋白酶级联放大系统的负向调控、昆虫体液免疫蛋白类效应分子合成与降解的负向调控和昆虫体液免疫模式识别过程的负向调控3个方面对昆虫体液免疫负向调控因子的研究进展进行了概述，以期为昆虫免疫防御的调控研究及应用提供理论基础。

1 丝氨酸蛋白酶级联系统的负向调控

丝氨酸蛋白酶级联放大系统是由昆虫体内游离的丝氨酸蛋白酶(Serine proteases，SPs)逐级激活形成的级联放大系统，激活迅速、反应灵敏。当SPs级联系统被激活后，微弱的病原体入侵信号被级联反应快速放大并向下游传递，末端活化的丝氨酸蛋白酶或剪切无活性的酚氧化酶原(Prophenoloxidase，PPO)为有活性的酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)，催化黑色素的产生，抵御病原体的入侵；或通过激活Toll通路诱导抗菌肽的生成以消灭病原菌[7]。而靶向丝氨酸蛋白酶的抑制剂则在此过程中通过调控SPs的活性，将免疫反应限定在一个安全的范围内，避免了宿主的过度免疫。研究发现，靶向丝氨酸蛋白酶的抑制剂有丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine proteinase inhibitors，Serpins)和Kunitz型蛋白酶抑制剂(Kunitz-type protease inhibitors，KPIs)。

1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.1.1 Serpins结构特点与作用机制 Serpins是蛋白酶抑制剂中数量最多的一个家族。根据其功能不同可分为抑制型Serpins和非抑制型Serpins。其中，抑制型Serpins具有相似的结构特征，通常由350～500个氨基酸组成，分子量约40～50 kDa，其结构主要由保守的蛋白主体(α螺旋、β-折叠)及具有靶酶特异性识别位点(P1)的反应中心环(reactive center loop，RCL)组成[8]。抑制型Serpins不仅结构相似，对丝氨酸蛋白酶的抑制机制也大致相同。通常情况下，蛋白酶可与Serpins RCL上的剪切位点(P1-P1’)结合，形成过渡态米氏复合物。随后，RCL上P1端的氨基酸与蛋白酶之间形成共价键，导致P1-P1’间的肽键断裂，经过系列结构变化，最终形成稳定的Serpin-蛋白酶复合物，通过致使靶酶失活而发挥抑制作用，这种作用机制即被称为自杀性抑制[9]。

1.1.2 Serpins对昆虫体液免疫的负向调控作用 目前，已在昆虫中鉴定出1 500余种Serpins超家族成员，大多数Serpins主要功能是抑制丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶的活性，进而参与昆虫免疫应答的负向调控过程。但非抑制型Serpins则不具有自杀性抑制丝氨酸蛋白酶活性的功能，通常作为储藏蛋白、激素的前体、激素转运体及辅助蛋白折叠的分子伴侣等行驶生理功能[10-11]。目前，Serpins针对生理发育的相关功能已在绝大多数昆虫中得到广泛研究，但其免疫相关功能仅在果蝇、烟草天蛾和黄粉虫等少数昆虫中较为明确。研究发现，Serpins主要通过抑制昆虫丝氨酸蛋白酶级联放大系统特定游离靶酶的活性进而对体液免疫应答起负向调控作用。

在果蝇中发现多种Serpins参与调节先天性免疫应答。其中，Serpin-77Ba可以抑制PPO-AS中黑化作用蛋白酶MP1和MP2的活性，从而抑制黑色素的形成；Serpin-27A通过与酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase-activating enzyme，PPAE)共价结合来抑制黑化反应；Serpin-28D可抑制PPO的剪切激活从而抑制PPO-AS，Serpin43Ac与Toll途径负调控相关[12-15]。

在黄粉虫中，病原体分子模式和模式识别蛋白复合体激活模块化丝氨酸蛋白酶(Modular serine protease，MSP)后，向下顺序激活Spätzle激活酶(Spätzle activating enzyme，SAE)和Spätzle加工酶(Spätzle-processing enzyme，SPE)[16]。SPE作为此通路的末端丝氨酸蛋白酶，不仅可直接激活Pro-Spätzle，活化的Spätzle与细胞膜受体Toll结合，促使Toll信号传导途径的激活；还可剪切活化PPO，诱导PPO-AS的激活，形成黑化反应。现已研究证实，Serpin-40、-55和-48可分别与上述丝氨酸蛋白酶形成共价复合物，即Serpin-40/MSP、Serpin-55/SAE和Serpin-48/SPE，通过抑制三步丝氨酸蛋白酶级联反应对Toll信号传导途径和PPO-AS起到负向调控作用。

在烟草天蛾中，已发现10余种抑制型Serpins。其中，Serpin-1J不仅通过抑制血淋巴蛋白酶HP8的活性降低Toll信号传导通路的激活程度，还可与酚氧化酶原激活酶PAP-1和PAP-3共价结合，对PPO-AS起到负向调控作用；Serpin-3能通过抑制PAP-1和PAP-3的活性来负向调控PPO的剪切激活；Serpin-4和Serpin-5对HP6均具有抑制作用，且Serpin-4还可抑制HP21的活性进而负向调控PPO-AS的激活；Serpin-6和Serpin-7可抑制PAP-3的活性从而对烟草天蛾的黑化反应起到负向调控作用；Serpin-6和Serpin-9能够与HP8共价结合，通过抑制Toll通路抑制抗菌肽的合成；Serpin-9和Serpin-13通过封闭SPs级联反应中的HP6活性抑制PPO-AS和Toll通路的激活；Serpin-12则可与HP14共价结合进而抑制PPO的激活，目前，烟草天蛾中仅Serpin-2尚未发现具有免疫相关功能[17-20]。

随着研究的深入，Serpins在其他鳞翅目昆虫物种中的免疫相关功能也被陆续被发现。如，家蚕中，Serpin5通过与HP6和SP21形成复合物，抑制PPO-AS和Toll通路的活性；Serpin-32通过抑制PAP-3的剪切激活从而抑制黑化反应的发生；Serpin6和Serpin15均能抑制PPO的活化和抗菌肽的表达，Serpin28则抑制抗菌肽的合成，但其具体的作用机制尚不可知[21-25]。柞蚕Serpin-6和Serpin-14可抑制其体内的黑化反应，调控由病原体侵染介导机体的免疫激活程度[26-27]。柞蚕Serpin-3在抑制PPO激活的同时，还可以抑制Toll通路的关键蛋白Spätzle及多种抗菌肽的产生[7]。但目前家蚕及柞蚕等昆虫中多数Serpins的靶酶尚未确定。此外，CHU等[28]在亚洲玉米螟中克隆得到Serpin-3 cDNA全序列的研究表明，其与丝氨酸蛋白酶SP13形成复合物，从而抑制真菌诱导的PPO-AS及抗菌肽的表达。另一方面，YUAN等[29]在棉铃虫中利用蛋白质组学和免疫印迹分析发现，在杆状病毒感染后，Serpin-5及Serpin-9的表达量升高，说明其与病毒介导的免疫应答相关；进一步试验证明，Serpin-5和Serpin-9分别通过抑制丝氨酸蛋白酶cSP4和cSP6来调节黑化反应进而抑制病毒感染。

1.2 Kunitz型蛋白酶抑制剂

1.2.1 KPIs结构特点与作用机制 KPIs是动植物在长期进化过程中所形成的一类抑制性多肽，因1945年由Kunitz首次从大豆中分离而得名，在昆虫的生存和发育过程中具有重要作用。KPIs家族成员的氨基酸序列同源性较高，空间结构相对较保守，通常含有一个独特的Kunitz结构域，由2对或3对高度保守的二硫键维持蛋白的空间结构，但也有部分KPIs只有1对甚至不含有二硫键，推测其依赖氢键来维持结构的稳定[30-31]。KPIs通常呈β-三叶草形状，其抑制中心突出于三维结构的表面且可通过深入到靶酶的底物口袋，形成稳定的靶酶-抑制剂复合物来封闭靶酶的活性中心，从而抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的活性[32]。

1.2.2 KPIs对昆虫体液免疫的负向调控作用 迄今为止，在昆虫中已发现多种KPIs。RAMESH 等[33]从烟草天蛾中鉴定出2种KPIs(HLTIs A和B)，其不仅可以抑制血淋巴中PPO的激活，还可保护昆虫免受入侵寄生虫所分泌的蛋白酶所侵害。蓖子硬蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂IrSPI也是一种Kunitz型抑制剂，其可降低T淋巴细胞的增殖能力及促炎细胞因子的分泌，从而调节宿主的免疫应答反应[34]。亚洲璃眼蜱11 kDa蛋白HA11具有抗凝血的作用，相同现象也在果蝇中被发现；用细菌或真菌感染果蝇，可使其体内两种KPIs的表达量增加，说明KPIs具有免疫相关性，可能参与果蝇的免疫应答[35-36]。尽管上述KPIs凝血作用的抗凝作用机制目前还不明确，但可以此为基础开发新型的抗凝药物和防治寄生虫疫苗。此外，美洲钩虫中发现的NaKuI3可通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性进而抑制宿主的炎症反应和免疫应答[37]。当变异革蜱中被立克次氏体感染时，KPI在中肠的表达量持续增加，体外试验也证明变异革蜱中的KPI可影响小鼠成纤维细胞的立克次氏定殖，推测这可能与KPIs胰蛋白酶抑制能力有关[38]。

2 昆虫体液免疫蛋白类效应分子合成与降解的负向调控

2.1 对IMD通路的负向调控

对昆虫免疫效应分子合成的抑制也是针对体液免疫负向调控的重要手段之一。胡杰等[39]从家蚕中鉴定得到的Caspase-8-Like蛋白可通过抑制家蚕转录因子Relish的切割，通过负调控IMD信号通路来抑制抗菌肽基因(如Cecropin A1)的表达。在果蝇中发现2种可能对IMD通路具有负调控作用的因子：一是锌指同源结构域zfh1，当敲除果蝇S2细胞中的zfh1后，IMD通路介导的抗菌肽Cecropin B表达量增加，但Toll通路介导的Drosomycin表达却不受影响[40]；二是潜在的免疫效应分子合成负向调控因子是Morris等在果蝇中发现的一种I κB超家族蛋白Pickle，其可通过与Relish和组蛋白去乙酰化酶dHDAC1相互作用，抑制IMD通路的过度激活。但当Toll和IMD通路同时激活时，Pickle只影响由RelN驱动的抗菌肽的诱导[41]。目前，上述2因子的负向调控具体机制尚不清楚。

2.2 泛素化和去泛素化酶的负向调控

平衡泛素化和去泛素化之间的关系对调节昆虫免疫信号通路尤为重要。现已研究证实：一些泛素化和去泛素化酶对体液免疫效应分子的转录过程具有负调控作用。例如，果蝇中的去泛素酶Trabid可与TAK1相互作用，降低免疫信号输出和k63连接的泛素化，从而抑制IMD信号通路[42]；去泛素化酶Fas相关因子(Fas associated factor，FAF)可诱导IMD的多泛素化，从而抑制IMD通路中抗菌肽Diptericin的表达[43]。而家蚕FAF则通过与Relish结合并促进其降解，最终抑制IMD信号通路的激活[44]。

3 昆虫体液免疫模式识别过程的负向调控

模式识别受体对外来入侵者的免疫识别被认为是启动先天性免疫系统进而产生信号传导的“开门砖”，但也有研究表明，一些模式识别受体不仅能识别病原菌表面的模式分子介导免疫反应的激活，还可通过抑制其他模式识别受体的模式识别能力的方式对昆虫体液免疫起到负向调节作用。然而关于模式识别过程负向调节昆虫免疫的研究甚少，目前仅对肽聚糖模式识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)超家族成员参与调控体液免疫应答的研究相对较为清楚。果蝇体内存在多种PGRPs，根据分子量大小将其分为长型和短型PGRPs，即：PGRP-Ls和PGRP-Ss。多数果蝇PGRPs可通过识别入侵细菌表面的典型PAMP-PGN启动先天性免疫应答，但也有一些PGRPs却对体液免疫信号通路起到抑制作用。例如，PGRP-LF可与Imd途径的主要跨模型PRR-PGRP-LC形成异二聚体，通过阻止PGRP-LC识别PGN进而负向调控由Imd途径介导的抗菌肽转录[45]；此外，PGRP-LB、-SB和-SC还可利用其自身酰胺酶活性促使PGN裂解，通过降低入侵PGN的激活浓度进而下调PGRP-LC模式识别的方式抑制Imd通路的激活[46-47]。

4 问题与展望

4.1 问题

多样的免疫负向调控因子及其精准的调控机制是昆虫既能抵御病原微生物入侵威胁又能正常生理发育的重要保障。虽目前已在昆虫免疫抑制剂研究方面取得了阶段性进展，但有关昆虫体液免疫负向调控的相关理论仍有许多问题尚不清楚。具体内容可分为如下几方面：

首先，丝氨酸蛋白酶级联系统是PPO-AS介导的黑化反应，是由Toll、IMD途径介导的抗菌肽合成两大体液免疫反应胞外激活途径的重要组成部分。目前已鉴定出许多具有针对上述级联系统的Serpins类和KPIs类免疫抑制剂，但有关两者的研究尚不够深入。就Serpins而言，除黄粉虫和烟草天蛾外，绝大多数昆虫体内发现的Serpins参与调控的具体免疫信号通路及其共价抑制的靶酶类型仍不清楚。而作为发现数量仅次于Serpins的KPIs类抑制剂，绝大多数相关研究尚处于免疫抑制现象发现阶段，目前尚无明确阐述其抑制靶酶、参与调控体液免疫应答的类型及调控具体分子机制的相关研究报道。

其次，对入侵病原体的模式识别是启动昆虫免疫应答的物质基础，“病原体-模式识别受体”复合物的形成数量及亲和力大小直接决定激活免疫反应的强度和时间，所以针对模式识别过程的抑制因子也可被认为是一种有效的昆虫免疫抑制剂。然而，目前这部分内容的相关研究甚少，但由果蝇PGRPs的研究结果可以推测：昆虫体内的某些模式识别受体可能在特定情况下也充当“免疫抑制剂”的角色。

最后，信号通路激活所产生的免疫效应分子是清除入侵病原体的直接杀伤利器。抑制免疫效应分子的数量及其活性也属于免疫反应负向调节的一种有效方式，但目前针对此部分内容的研究几乎空白。其中，针对抗菌肽合成抑制剂的相关研究，可将重点锁定在介导抗菌肽激活的Toll、IMD和JAK/STAT途径胞内信号传导通路，发现并鉴定的细胞核中针对抗菌肽转录具有抑制作用的细胞因子；而针对抗黑色素形成相关抑制剂的研究，则需在深入了解黑色素形成的机制并锁定其形成所必需的关键物质基础上，寻找体液中针对各种关键蛋白的抑制剂。

4.2 展望

抗病虫害一直是动植物科学领域的热门研究话题，目前已研制出多种有效的农业和畜牧业杀虫剂，但这些产品由不同的活性成分组成，大多数活性成分为化学物质，此类药物虽杀虫效果良好，但药物残留、环境污染、耐药性等问题也日益突出。因此，寻找并研发新型无害无污染杀虫剂成为了当今抗病虫害研究的新目标。而昆虫体液免疫负向调控因子的蛋白质属性、无害性及对免疫系统抑制作用的有效性为研发新型、无污染、生物制品类杀虫剂开辟新思路。例如，将昆虫Serpin的编码基因利用基因工程手段导入昆虫病原真菌——白僵菌中，以表达昆虫Serpin的白僵菌作为杀虫剂感染昆虫，高效表达的Serpin可有效抑制宿主昆虫的免疫反应以保证白僵菌在宿主昆虫中的有效繁殖，最终达到杀死宿主昆虫的目的[15]。此外，目前KPIs在抗凝血、抗肿瘤等方面的研究成果也适合用于研制人类的抗凝药物及防治寄生的昆虫疫苗等。

简而言之，负向调控因子在昆虫免疫反应调节和维持免疫稳态方面起到极其重要的作用，开展针对昆虫负向调控因子及其调控分子机制的研究，不仅能为深入了解昆虫免疫信号通路及其调节机制提供理论依据，同时，也能为研发适用于农业、畜牧业、医疗等应用领域相关制品提供必要的理论依据和物质基础。