曾 圣， 刘 伟， 杜 强， 王艳艳， 周 洲， 胡世然

(1.贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特种水产工程技术中心, 贵州 贵阳 550025； 3.黔东南州农业科学院 水产研究所， 贵州 凯里 556000)

鲤(Cyprinuscarpio)属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲤亚科、鲤属，在我国除西部高原外，各地淡水中均有分布，是养殖历史悠久(2 400余年)的重要养殖鱼类。我国幅员辽阔、水资源丰富，有多个地方鲤鱼种群，如黄河鲤、镜鲤、兴国红鲤等，因而我国是巨大的鲤鱼种质资源库。近年来，通过杂交育种形成的福瑞鲤、松浦镜鲤等高产优质新品种取得了巨大的经济效益和社会效益[1-3]。

清水江鲤是贵州省黔东南州、黔南州等地稻田主要养殖的鱼类品种，具有较高的经济价值。由于梯级电站开发、增殖放流及人工养殖新品种的引入，野生清水江鲤的数量日趋减少，其种质资源遗传多样性也受到了一定程度的破坏。

目前，对清水江鲤的研究相对较少，董在杰等[4]通过微卫星标记和形态指标对清水江鲤的种质资源现状的研究结果表明，清水江鲤群体表现出较高的遗传多样性水平，且群体内存在显著遗传分化。周洲等[5]通过测定清水江鲤8个形态学指标，研究清水江鲤外部形态性状对体质量的影响表明，体长、体高、体厚、尾柄高、尾柄长是影响清水江鲤体质量的主要性状。胡世然等[6]研究了清水江鲤在池塘养殖条件下的适应温度范围、最适摄食生长温度、溶氧需求及pH适应范围等的结果表明，野生清水江鲤可经人工驯化为淡水名优养殖鱼类。胡世然等[7]将清水江鲤与江西兴国红鲤进行杂交改良，清水江鲤杂交改良子一代稻田饲养增产效果显著。

人工选育是开发和保护清水江鲤种质资源的重要手段之一，为了解清水江鲤早期性腺发育及性腺发育过程中相关基因的表达，通过组织学切片观察不同时期清水江鲤性腺，并通过RACE及RT-PCR克隆清水江鲤Foxl2基因，并分析Foxl2的功能，以期为清水江鲤的人工选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

清水江鲤苗种及成鱼由凯里市福瑞水产养殖场提供。

1.2 方法

1.2.1 性腺样品采集及观察 选取孵化后50 d、70 d、90 d、120 d、150 d和240 d清水江鲤性腺进行组织学切片观察，以了解清水江鲤的性腺发育情况。清水江鲤性腺用波恩氏液固定过夜，70%酒精洗涤后，参照刘凯等[8]方法采用常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明及石蜡包埋，运用浙江科迪KD2508轮转式切片机进行连续切片，切片厚度为6 μm，H.E染色，中性树胶封片，NIKON E50i显微镜下观察并拍照，应用Photoshop CS 6.0编辑图片。

1.2.2 免疫组化 为观察清水鲤早期生殖细胞分化情况，运用上述孵化后50 d及90 d切片进行免疫组化染色，抗体选用Vasa兔多克隆抗体(生殖细胞特异性抗体)。免疫组化主要参考DONG等[9]的方法。用0.01 M PBS洗涤3次，每次洗涤10 min后，将切片浸入含有0.1%吐温20的0.01 M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中煮5 min。用Vasa兔多克隆抗体(1∶1 000)在4℃下孵育过夜，用0.01 M PBS冲洗3次，每次冲洗5 min。随后，将组织切片与二抗(羊抗兔IgG)和辣根过氧化物酶以1∶2 000比例孵育30 min，然后用PBS冲洗3次，每次冲洗5 min。以二氨基联苯胺为底物，观察免疫反应信号。切片用苏木精复染。

1.2.3Foxl2基因序列获取 通过对项目组前期开展的清水江鲤成鱼雌雄性腺转录组测序数据(未发表)进行分析，获取清水江鲤Foxl2基因中间序列，并通过5′-和3′-RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)及与鲤鱼基因组序列比对获取Foxl2基因全序列。

1.2.4 系统发生 进化树包括人类(NP_075555.1)、小鼠(NP_036150.1)、鸡(AEE80502.1)、斑胸草雀(XP_002187454.1)、非洲爪蛙(BAH22852.1)、施氏鲟(BAZ96608.1)、许氏平鲉(AEX58659.1)、牙鲆(BAF69017.1)、青鳉(NP_001098358.1)、尼罗罗非鱼(NP_001266707.1)、红鳍东方魨(XP_003968794.2)、半滑舌鳎(NP_001281128.1)、金钱鱼(AGH32772.1)、尖吻鲈(XP_018539633)、斑马鱼(NP_001038717.1，NP_001304690.1)、稀有鮈鲫(ADN38241.1)、大口鲇(ABK76309.1)、斑点叉尾鮰(XP_017350481.1)、金鱼(XP_026092361.1、XP_026055792.1和XP_026138658.1)、七彩神仙鱼(AVP26899.1)、虹鳟(NP_001117956.1和NP_001117957.1)、大西洋鲑(XP_013992219.1)、日本鳗鲡(AXM42349.1和AXM42348.1)、黄鳝(AGM34484.1)、四川裂腹鱼(ASU44863.1)、克氏原螯虾(ALD48735.1)和居蟹皮海绵(CAE51212.1)的Foxl2氨基酸序列。

进化树以NJ法采用MEGA 6.0[10-12]构建。人类Foxl1(NP_005241.1)作为外类群。数值表示1 000次试验所得到的步展值，代表每一分支的可信度。除清水江鲤Foxl2a与Foxl2b为试验克隆外，其余Foxl2蛋白序列来源于NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库。

1.2.5Foxl2在清水江鲤成体组织中的表达 成体(24个月)清水江鲤麻醉后按性别解剖取其脑、垂体、鳃、心脏、脾脏、肝脏、肠、卵巢、精巢及肾脏液氮速冻，组织匀浆后按RNAiso Plus操作说明提取总RNA，提取的总RNA(约5.0 μg)用DNase I处理，以减少或避免基因组DNA的污染。取总RNA(约2.0 μg)逆转录合成cDNA，用基因特异引物进行扩增，检验Foxl2a和Foxl2b在各个组织中的分布情况。同时以鲤鱼β-Actin引物扩增为内参以验证PCR过程中cDNA的质量。PCR扩增参数：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃30 s，72℃60 s，循环28圈；72℃最终延伸10 min，4℃保存。所有PCR产物最后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，并用SYBR Green I染色后在凝胶成像系统中拍照记录结果。

2 结果与分析

2.1 清水江鲤性腺的早期发育

通过组织学切片观察发现，清水江鲤发育在孵化后50～90 d不能分辨性别(封2图1a～c)，但能明显分辨出生殖细胞，免疫组化(以Vasa为抗体)染色显示生殖细胞为椭圆形，细胞核偏大(封2图1a和c)；孵化后120 d的性腺出现初级精母细胞，初级精母细胞呈圆形小颗粒状，胞质弱嗜酸性(封2图1d)；孵化后150 d的性腺出现初级卵母细胞，初级卵母细胞呈圆形，核膜的内壁有核仁(封2图1e)；孵化后240 d出现精细胞(封2图1f)。

2.2 清水江鲤Foxl2序列比对及系统发生情况

基于RT-PCR、RACE和转录组数据发现，清水江鲤含有2个同源基因(Foxl2a和Foxl2b)， cDNA全长分别为1 057 bp和1 297 bp，完整ORF分别编码307个和263个氨基酸。

通过对NCBI数据库的搜索及比对，目前仅发现在硬骨鱼类的斑马鱼、虹鳟、日本鳗鲡、金鱼、斑点叉尾鮰、大西洋鲑及七彩神仙鱼中存在Foxl2b，其中金鱼存在2个Foxl2b(图2)。

序列比对发现，清水江鲤Foxl2a与Foxl2b核苷酸序列相似性为50.16%，氨基酸序列相似性为44.01%。

通过氨基酸序列的比对，Foxl2a在硬骨鱼类间有高度相似性，特别是中间区域Foxl家族含有的1个高度保守的约110个氨基酸的DNA-binding domain(DBD)(图3)，氨基酸序列间的相似性为75.88%～99.02%。Foxl2b氨基酸序列仅在DBD区域相对保守(图4)，其余区域相对不保守，氨基酸序列之间相似性为30.72%～90.08%。

2.3 Foxl2在清水江鲤成体组织中的表达

从图5看出，清水江鲤Foxl2a仅在成体卵巢、肾脏及脾脏中表达，且在卵巢中的表达量高于脾脏和肾脏；Foxl2b仅在成体卵巢中表达。

注：B为脑，P为垂体，G为腮，H为心脏，S为脾脏，I为肠，L为肝脏，K为肾脏，T为精巢，O为卵巢，HK为头肾。β-Actin为内参。

Note: B, brain; P, pituitary; G, gill; H, heart; S, spleen; I, intestines; L, liver; K, kidney; T, testis; O, ovary; HK, head kidney.β-Actin, internal reference.

图5清水江鲤成体组织中Foxl2a和Foxl2b的表达模式

Fig.5 Expression pattern ofFoxl2aandFoxl2bin adult tissues of QingshuijiangC.carpio

3 结论与讨论

清水江鲤性腺发育至孵化后90 d时，通过免疫组化(以生殖细胞特异性表达的Vasa为抗体)可以看到性腺中存在大量生殖细胞，但通过HE染色仍不能明显分辨性别，而黄河鲤在80 d时性腺已出现组织学上明显的分化[13]。清水江鲤性腺发育明显晚于黄河鲤性腺发育，可能是由于清水江鲤主要分布于贵州省黔东南州、黔南州等地区，海拔相对较高、气温相对较低所致。此结论将为清水江鲤人工繁殖及选育提供理论基础。

研究获得清水江鲤2个Foxl2的同源基因Foxl2a和Foxl2b，并通过系统发生验证。

目前仅在硬骨鱼类的斑马鱼、日本鳗鲡、金鱼、虹鳟及鲤中发现2个(或以上)Foxl2旁系同源基因，其中金鱼存在2个Foxl2b旁系同源基因，而在人类、小鼠、鸡、斑胸草雀、非洲爪蛙等四足类中未发现2个(或以上)Foxl2旁系同源基因，表明，鱼类基因组中存在的2个Foxl2旁系同源基因可能是由发生在辐鳍鱼出现早期的额外的基因组复制(鱼类特有的基因组复制，3R)产生[14-15]。金鱼中存在2个Foxl2b基因可能与金鱼与鲫鱼共同祖先发生的特有基因组复制(4R)相关[16]。其他鱼类仅存在1个Foxl2旁系同源基因可能是由于大部分鱼类基因组测序尚未完成，还未发现其他的Foxl2旁系同源，也有可能是进化过程中全基因组复制往往伴随着快速的基因丢失[17]所致。

氨基酸序列分析表明，硬骨鱼类Foxl2a氨基酸序列相对保守，特别在中间及C末端区，其在不同物种中的功能也较相似；而Foxl2b相对不保守，其在不同物种中的功能可能会有所不同。

对哺乳动物的研究表明，Foxl2(与硬骨鱼类Foxl2a同源)几乎参与了卵巢发育和功能的所有阶段及颗粒细胞相关的病理学。Foxl2通过与细胞DNA结合来打开或关闭某些基因，帮助颗粒细胞发育和功能[18-19]。在斑马鱼中的研究表明，Foxl2a和foxl2b协同调节斑马鱼卵巢的分化和维持，Foxl2b在阻止卵巢分化为睾丸方面起主导作用[20]。与其他脊椎动物(包括硬骨鱼类)不同，三斑海猪鱼Foxl2在自然改变性别的鱼类中可能有不同的作用[21]。BARON等[22]发现，虹鳟Foxl2a和Foxl2b在卵巢中有特异表达，但表达的时间模式不同。Foxl2a的表达与芳香化酶的水平相关，雌激素处理遗传雄性个体则会使Foxl2a与Foxl2b的表达上调。通过RT-PCR发现，清水江鲤Foxl2a和Foxl2b均在卵巢有较高表达，而在精巢没有表达，这与Foxl2a和Foxl2b在虹鳟中的情况相似，表明Foxl2a与Foxl2b能在清水江鲤雌性性腺发育过程中起重要作用。清水江鲤Foxl2a和Foxl2b的具体功能，还有待进一步研究。