张秀森，刘怡文，孔金玉，郭艺博，孙玲云，褚洛颐，原 翔,2，高社干,2，侯旭荣

牙周炎是一种由革兰氏阴性菌引起的慢性口腔炎症性疾病，疾病表现为牙龈出血、牙龈组织和牙槽骨严重发炎，最后导致牙齿脱落。此外，感染牙周炎还会增加类风湿关节炎、动脉粥样硬化、癌症和早产的风险，从而影响全身健康。普遍认为，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是革兰氏阴性专性厌氧的产黑色素杆菌，是引起牙周炎的主要病原体，它利用半胱氨酸蛋白酶Gingipains作为其主要毒力因子[1]。Gingipains包括两种具有严格精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)特异性的相关蛋白酶：精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(arginine-specific cysteine proteinase,Rgp)，以RgpA和RgpB两种形式存在，分别由RgpA和RgpB基因编码；赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(lysine-specific cysteine proteinase,Kgp)，由Kgp基因编码[2-3]。RgpA基因编码的蛋白质由N末端前肽体，相对分子质量4.5×104的精氨酸特异性钙稳定性的RgpA催化结构域和4个序列相关性的黏附结构域RgpAA1、RgpAA2、RgpAA3和RgpAA4组成。RgpB基因编码的RgpB蛋白由N末端前肽区和催化结构域构成，无C末端黏附结构域。Kgp基因编码的蛋白质由N末端前肽体，相对分子质量4.8×104的赖氨酸特异性Kgp催化结构域和5个C末端黏附结构域KgpA1、KgpA2、KgpA3、KgpA4和KgpA5组成。RgpA和RgpB之间的主要区别在于前者形成了一个大型非共价的催化和血凝素/黏附(hemagglutinin/adhesion,HA)结构域，有时被称为HRgpA。RgpB是一种单链蛋白，其氨基酸序列与RgpA催化结构域几乎相同。Kgp也含有HA结构域，它与HRgpA相关结构域相互作用，形成一种非常有效的蛋白水解复合物，称为HRgpA-Kgp。因此，Gingipains对牙周的细菌存活和感染的病理结果都很重要。Gingipains是Pg黏附系统的一部分，该系统介导其黏附到口腔表面，负责获取生长所必需的营养物质以及免疫逃避。此外，Gingipains可以通过降解补体成分和免疫受体，以及通过灭活或激活各种细胞因子来破坏宿主的免疫反应。此外，Gingipains还能降解宿主细胞表面的蛋白，从而导致细胞脱落和失巢凋亡[1,4]。

Gingipains切割宿主细胞表面蛋白和释放膜蛋白可溶结构域的能力形成了Gingipains可以作为脱落酶的观点[5-6]，也可作用于其他细菌[7]。胞外结构域脱落是通过金属蛋白酶TACE(TNF-α转换酶，也称为ADAM17)生成可溶性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[8]。一般来说，所有的脱落酶都能将膜锚定蛋白的全部胞外结构域切割得非常接近膜(多达20个氨基酸残基)，导致可溶性胞外域释放到细胞外环境中，后者可能具有新的生物学作用。这最初被证明是来自ADAM(一种去整合素和金属蛋白酶域)和基质蛋白酶MMP家族的金属蛋白酶[9]，但后来也被证明可以是其他类型的金属蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶G和中性粒细胞弹性蛋白酶和半胱氨酸组织蛋白酶[10-11]。

由于蛋白酶信号是通过降解后其底物功能的调节来介导的[12]，因此本文重点研究牙周炎中Gingipains介导的信号传导。虽然降解是一种简单的方式，通常只会导致底物功能的丧失，但有限的处理(如膜锚定蛋白脱落的情况下)是一种更复杂的方法，会导致信号改变，这可能与宿主防御系统的颠覆有关。因此，细菌分泌的Gingipains是否主要降解其膜锚定的底物，是仅在一个位点或很少的位点降解它们，还是通过两种过程的组合来起作用，可能取决于疾病所处的阶段。但是，对Gingipains的生物学降解模式进行详细分析并不容易，因为大多数研究都是在受控条件下体外进行的，通常也与外源添加的Gingipains一起进行。

1 Gingipains底物

Gingipains可以从不同细胞膜分离出3种蛋白质：免疫调节蛋白、黏附蛋白和信号蛋白。这与Gingipains蛋白酶的水解活性相一致，该活性负责Pg的免疫逃逸、宿主细胞的脱离和随后的组织降解以及对牙龈细胞中众多信号通路的调节[4]。

2 免疫调节蛋白

Gingipains针对的是细菌感染免疫反应不同途径中的许多蛋白质。这些分子参与对入侵者的天然免疫即时反应或参与适应性免疫，甚至介导免疫两个分支之间的相互作用。总之，它们负责从体内有效地清除细菌。在这些蛋白质中，免疫调节蛋白是在Pg感染过程中被鉴定出的已知Gingipains宿主细胞表面底物中最大的一组。这些免疫调节膜蛋白包括非自身分子的受体，如髓系细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM-1)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)受体CD14，保护细胞不被巨噬细胞吞噬的受体或信号，如CD31、T细胞受体CD2、CD4和CD8，以及免疫反应激活产生的分子的受体，如补体成分(如CD46补体抑制剂)和细胞因子(IL6-R、TNF-α和CD27)。大量的膜免疫调节分子被Gingipains靶向、降解或脱落，进一步表明Gingipains的主要任务是帮助Pg逃避宿主免疫系统。

相当多的底物是先天免疫的一部分，或者至少与之紧密相连。TREM-1是巨噬细胞和多形核中性细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)表达的细胞表面受体。它在宿主细胞识别细菌后被激活，导致细胞因子的产生和炎症作用增强。当分离的PMNs用Pg处理时，发现Rgp是导致TREM-1从表面脱落的原因，而Kgp被证明可在条件培养基中缓慢降解可溶的TREM-1分子[13]。尽管如此，可溶性TREM-1在细胞液中稳定存在一段时间，可能调节炎症程度[14]，提示其降解可能与生理相关。对于CD14、单核细胞和巨噬细胞上的LPS受体，却不尽相同。据说，血凝素/黏附结构域有助于提高Gingipains对CD14的蛋白水解活性。因此，具有这些结构域的Kgp和HRgpA对CD14的降解效率更高，随后释放的CD14被Gingipains完全降解，没有任何生物活性[15-16]。这与Gingipains作为一种病理生理学相关途径而使CD14脱落是相反的，特别是CD14一旦从细胞表面释放出来，就没有了生物学功能，因此无论是完全降解还是功能丧失都无关紧要，这是CD14在细胞膜上降解的结果。在这两种情况下，CD14的功能丧失都会导致慢性炎症，这对牙龈组织中的嗜炎性细菌是有利的[17]。

补体系统是先天免疫的另一个重要部分，也是身体中非常强大的病原体检测器，它是Gingipains的靶点。在膜补体蛋白中，CD46和C5aR为Gingipains的底物。CD46是一种补体抑制剂，广泛表达在宿主细胞上，是补体系统的“不认识我”信号。Pg最初从上皮细胞表面降解出CD46，但经长时间孵育后，检测不出可溶性CD46[18]。Pg可能与其表面降解的碎片结合，保护其自身免受补体攻击。然而，在较高的浓度和较长的暴露时间下，观察到该分子完全降解，这表明Gingipains介导的CD46降解是存在时间和浓度依赖的。此外，在体内，Gingipains引起的CD46对上皮细胞的降解甚至可能导致补体介导的牙龈上皮损伤，从而有利于细菌侵入牙龈组织。

另一种补体受体是C5a受体(complement component 5a receptor,C5aR)，它由Gingipains蛋白水解处理。C5aR与补体激活后释放的一种强有力的趋化剂C5a结合，导致PMNs激活，随后将炎症和细菌从系统中清除。Kgp对PMNs表面C5aR的N-末端区域的消化作用最强。尽管有这种降解，C5aR仍可以结合C5a。另一方面，Rgp在降解C5aR方面效率不高，可能是因为连接C5aR胞外区和跨膜片段上没有暴露的Arg残基。当所有Gingipains都存在时，它们会协同作用，降解C5aR。一个合理的解释是，Kgp首先将受体从细胞膜上脱落，然后在后者上发生构象变化，导致Arg残基暴露在细胞表面，从而使其最终被Rgp降解[19]。因为参与的Toll样受体与C5aR之间存在交互作用，Kgp对C5aR蛋白水解失活似乎适得其反，导致吞噬细胞失去杀菌活性[20]。然而，在体内，C5aR的失活及其随后的降解，可能在某种程度上协同Pg阻止免疫细胞的正面攻击，促进其在发炎的牙周组织的恶劣环境中成长。

另一组Gingipains的靶点是巨噬细胞上的受体，因为后者在清除感染或改变的宿主细胞方面起着重要作用，这些蛋白的脱落可能会对巨噬细胞的功能产生严重的影响。一种是表达在PMNs上的CD31。它与巨噬细胞的同型相互作用决定了PMNs的命运。存活的细胞在相互作用后立即分离，而凋亡的细胞仍然附着在巨噬细胞上，并经历吞噬作用。Rgp可以通过巨噬细胞将CD31识别为“吃我”信号，保持附着在完全健康的PMNs上并吞噬它。这可能不仅是Pg用来逃避PMNs清除的另一种方式[21]，而且是其危害和劫持先天免疫力的整体过程的一部分，这有益于牙龈细菌菌落的生长。

获得性免疫是宿主抵御病原体的一种防御机制，是在先天免疫之后触发的。由于Gingipains的主要任务是免疫颠覆和逃避，所以Gingipains可以损害包括T细胞在内的免疫细胞反应。T细胞受体(T cell receptor,TCR)的辅助受体CD4和CD8都被证明是Gingipains的底物。据报道，用Pg生长的培养基处理细胞后，HRgpA中CD4和CD8的含量呈浓度依赖性下降[22]。CD2是一种单链糖蛋白，是另一种可以被Rgp和Kgp切割的T细胞受体，因为它含有几个Lys和Arg残基[23]。然而，没有关于这些蛋白质的降解结构域或蛋白水解片段在降解后的信息。

细胞因子是对病原体免疫反应的另一个重要部分，它们在细胞之间传递信号。因此，Gingipains作为Pg的主要毒力因子，具有降解和灭活细胞因子及其受体的能力。白细胞介素6受体(IL-6R)是Gingipains蛋白水解活性的靶点之一。目前尚不清楚是否会发生脱落和随后的降解，或者Gingipains会直接降解膜上的IL-6R，但无论如何，受体的结合能力都会丧失[24]。CD27是CD70细胞因子的T细胞受体，对T细胞活化非常重要。用Gingipains处理T细胞后，培养上清液中可溶性CD27大量积聚。在Gingipains中，HRgpA对CD27的脱落作用最强，其次是Kgp。然而，经过长时间的处理后，可溶性形式被完全降解[25]。肿瘤坏死因子-α也被称为Gingipains底物。HRgpA使膜形式的TNF-α从巨噬细胞表面脱落，而RgpB在降解新形成的可溶性TNF-α方面更为有效。因此，降解片段不会在培养基中积累，并失去TNF-α活性。另外，据推测，Gingipains至少部分降解了TNF受体(TNFR)。TNFR-Ⅱ和TNFR-Ⅱ也都含有大量的Arg-和Lys-残基，它们是Gingipains的潜在切割位点。这种降解与TNF-α蛋白水解一起会导致原始TNF-α与细胞之间的通讯和相互作用受损，从而导致宿主反应减弱[26]。

3 黏附蛋白

黏附蛋白构成了Gingipains的另一组膜锚定底物。其中最重要的是钙黏蛋白、整合素和细胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)。由于黏附蛋白在建立细胞与细胞的接触中起着重要作用，因此通过切割黏附蛋白，Gingipains很可能通过分解黏附蛋白使细胞与周围环境分离，从而诱导失巢凋亡，这是细胞程序性死亡的一种特殊形式[4,27]。

钙黏蛋白是钙依赖性黏附蛋白，对细胞—细胞连接很重要。上皮细胞上的N-钙黏蛋白仅被HRgpA和Kgp切割(但不被RgpB切割)成几个较短的片段。另一方面，VE-钙黏蛋白被所有Gingipains切割，其中HRgpA起主要作用[28-29]。E-钙黏蛋白与闭合蛋白对细胞—细胞和细胞—细胞外基质的黏附以及上皮细胞的细胞极性起重要作用，并且这两种蛋白质都是Gingipains的靶点。Kgp被认为是上皮E-钙黏蛋白降解的最大贡献者，而闭合蛋白则被所有Gingipains降解[30]。在所有这些例子中，钙黏蛋白都被完全降解，这肯定会对牙龈或牙龈沟上皮的完整性产生不利影响，促进细菌及其有害产物扩散到牙龈和牙周组织中。然而，E-钙黏蛋白被发现可由幽门螺杆菌HtrA1蛋白酶分泌，这可能与细菌感染有关[7,31]。

Gingipains靶向的下一组黏附分子是整合素，整合素是一种通过细胞内结构域将细胞外基质(extracellular matrix,ECM)与周围细胞连接起来的蛋白质。HRgpA主要降解β-1整合素亚基，而Rgp主要降解整合素α2和β3[32-33]。细胞和细胞外基质之间的这些连接被发现是通过失巢凋亡触发细胞死亡的，这也是组织破坏的一个原因。此外，细胞外基质本身可以被Gingipains蛋白水解处理。不同的成分有不同的Gingipains降解倾向。例如，通过用Gingipains处理，可以使纤维连接蛋白大量降解，从而阻止纤维连接蛋白与纤维连接蛋白受体α5β1整合素的结合[33-34]。然而，关于ECM的主要成分之——Ⅰ型胶原，作为Gingipains的潜在靶点，有相互矛盾的信息。虽然有几份报道描述了Gingipains能降解它，但也有其他报道的相反说法[35]。然而，随后对分离的Ⅰ型胶原进行的实验证明，与Kgp形成的复合物中的HRgpA实际上可以降解Ⅰ型胶原[36-37]。然而，应该注意的是，这些实验是在体外用纯化的Gingipains和重组或分离的胶原蛋白进行的，不一定保留底物的天然三螺旋结构。

此外，Gingipains还通过Gingipains依赖的其他因子的激活，间接参与细胞外基质的降解，进而刺激其他细胞外基质降解蛋白酶，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。其中一种因子是细胞外基质金属蛋白酶诱导物(extracellular matrix metalloproteinase Inducer,EMMPRIN)，它表达在上皮细胞和肿瘤细胞表面，它的膜结合形式和可溶性形式都能与成纤维细胞相互作用，诱导MMPs的分泌。Feldman等[6]证明，Pg处理上皮细胞系会导致EMMPRIN脱落。可溶性EMMPRIN是稳定的，并且没有进行进一步的蛋白水解。但是，可溶性EMMPRIN从细胞表面释放的任何病理生理学过程均不清楚。

Pg尽管通常在口腔中发现，但在牙龈出血时可以进入血液，然后播散并引发新的炎症。因此，Gingipains可以蛋白水解处理内皮细胞黏附分子也就不足为奇了。其中内皮黏附分子起主要作用的一个非常重要的事件是白细胞从血液中迁移到炎症组织中。这是通过内皮细胞和迁移的白细胞之间的一系列黏附事件发生的。其中，ICAM-1、VCAM-1和PECAM-1在这些步骤中非常重要。内皮细胞上的血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)对Gingipains的降解具有时间和剂量依赖性。因此，可以得出结论，Gingipains直接降解内皮细胞表面的PECAM-1[38]。参与白细胞跨血管迁移的内皮细胞表面蛋白CD99也显示了同样的结果，它被认为在同型细胞黏附中起重要作用[39]。细胞内黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达在多种细胞上，包括内皮细胞和牙龈上皮细胞，感染开始时，Gingipains会直接降解ICAM-1[40-41]。总之，CAMs是Gingipains非常重要的目标，因为其降解会阻碍白细胞流入炎症和感染部位，从而阻止细菌的有效清除。

4 细胞信号蛋白

Gingipains的另一个作用是干扰宿主信号传导途径。通过这些方法，Gingipains破坏了局部信号，并使它失去功能，无法起到保护作用和清除细菌的作用。其中最知名的Gingipains底物是生长因子受体，例如多聚体蛋白聚糖(syndecan-1)、凝血途径成分和蛋白酶激活受体(protease-activated receptors,PARs)。

Syndecan-1是细胞表面蛋白多糖，是多种生长因子和细胞外基质蛋白的共同受体。当降解时，胞外区域可以起到炎症调节的作用。Andrian等[5]证明了用Pg上清处理牙龈上皮细胞增加了培养基中可溶性sycndecan-1的量。此外，释放的完整胞外域可能有助于解除先天防御机制的武装，从而促进Pg逃避免疫清除[42]。

Gingipains干扰的另一个信号传导途径是凝血途径。尽管Gingipains干扰该途径的几个成分，但血栓调节蛋白是唯一的膜锚定靶点。血栓调节蛋白是一种内皮表面糖蛋白，结合凝血酶，然后进一步调节凝血抑制作用。Gingipains从内皮细胞系表面脱落血栓调节蛋白，但释放的可溶性蛋白不具备进一步调节凝血途径的能力，并且可能被降解[43]，这可能会加重感染Pg的牙周炎部位的出血倾向。

PARs是一组膜G蛋白偶联受体，在其N端被宿主蛋白酶进行蛋白水解切割后，进行信号传导。但是，Gingipains也具有降解和激活PARs的能力。目前已知有4种PARs，即PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，它们都曾被报道为Gingipains底物。Gingipains可以激活血小板表达PAR-1、低表达PAR-4，其中HRgpA最有效，其次是RgpB[44]。在上皮细胞上，可以找到PAR-1、PAR-2和PAR-3。具有Arg特异性的RgpB可以激活PAR-1和PAR-2，但对PAR-3没有影响。后者在降解位点含有Lys残基，因此只能被Kgp激活，但未被证实[45]。Gingipains激活的PARs既不脱落也不降解，它仅仅在特定切割位点使有限的蛋白水解，可导致信号传导途径被激活，并可能导致血小板激活及其聚集或诱导不同的白介素。所有这些都会导致宿主细胞免疫系统紊乱以及细菌清除不成功。在这种情况下，PARs在牙周组织的稳态中起着非常关键的作用[46]，而且PAR-2对于牙周炎的发病机制至关重要[47]。

5 结论

Gingipains因其蛋白水解活性而起到逃避或调节宿主免疫防御的作用。为了阐明Gingipains切割靶点的机制，本文讨论了Gingipains的3组不同的靶点膜蛋白。所有Gingipains底物的降解/加工都是相互协同的，其目的都是帮助Pg在宿主口腔中生存。因此，Gingipains的主要功能是诱导宿主蛋白的功能丧失。至于蛋白质是通过一次裂解失活，还是额外加工，甚至随着时间的推移而降解，似乎与疾病进展有关。在早期阶段，Pg在口腔中的数量很少，而Gingipains的浓度较低，因此只在一个或少数几个靶点降解底物。后来随着Gingipains浓度增高，并主要降解细胞膜靶点，从而接管了许多宿主免疫反应调节和信号传导途径，逃避和破坏了免疫系统，最终导致组织破坏。

(致谢：感谢孙蔚、梁嘉等人提供的帮助！)